不同剂量甲状旁腺素对下颌骨牵张成骨新骨质量的影响*＊?

白　硕，王冬香，朱鹏娜，唐正龙＊＊

(1.贵州医科大学附院口腔颌面外科，贵州贵阳　550004; 2.杭州市口腔医院，浙江杭州　310000)



不同剂量甲状旁腺素对下颌骨牵张成骨新骨质量的影响*＊?

白硕1，2，王冬香1，朱鹏娜1，唐正龙1＊＊

(1.贵州医科大学附院口腔颌面外科，贵州贵阳550004; 2.杭州市口腔医院，浙江杭州310000)

［摘要］目的:研究不同剂量重组人甲状旁腺素(rhPTH)对下颌骨牵张成骨新骨形成及质量的影响。方法:日本大耳白兔45只，随机均分为对照组和实验A、B、C、D组，在前牙和第一磨牙交界处垂直于下颌骨下缘，用慢速裂钻作截骨线，牵张延长下颌骨10 mm，对照组动物隔日皮下注射生理盐水1 mL，实验A、B、C及D组分别隔日皮下注射rhPTH 10、20、30、40 μg/kg，在固定期第1、7及14天时行牵张区新骨组织形态学研究和骨密度检测。结果:各固定期实验组的成骨细胞数量、骨小梁面积和骨密度均较高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05) ;在固定期第1天时实验C组的平均成骨细胞数量和骨密度最高，随固定期延长，各组新骨骨密度和骨小梁面积逐渐升高，而成骨细胞数量逐渐减少。结论:间断皮下注射rhPTH可以促进下颌骨牵张成骨新骨生成，不同剂量rhPTH促进下颌骨牵张成骨可能存在剂量效应差异。

［关键词］重组人甲状旁腺素;牵张成骨;下颌骨;骨密度;成骨细胞

＊＊通信作者E-mail: zhenglongtang@ hotmail.com

网络出版时间: 2016－02－23网络出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.1849.012.html

加速牵张成骨(distraction osteogenesis，DO)新骨生成并缩短牵张成骨疗程是当前口腔热点研究课题。新骨的形成和代谢受多种因素的调节，包括激素及其受体、细胞因子等。甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是甲状旁腺主细胞分泌的维持机体内钙磷代谢平衡的一种重要的调钙激素，能够调节骨骼的合成代谢和分解代谢过程。目前尚未见应用不同剂量PTH促进颌骨牵张成骨的文献报道。本实验通过建立下颌骨牵张成骨模型，并间断性皮下注射不同剂量的重组人甲状旁腺素(recombinant human parathyroid hormone，rhPTH)，采用组织学形态计量学观察分析和骨密度检测，研究不同剂量rhPTH对下颌骨牵张成骨新骨形成及成骨质量的影响，为应用PTH促进颌骨牵张成骨提供理论支持和实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组

选用日本SPF级大耳白兔45只，5月龄，雌雄不限，质量(2.5±0.2) kg，由贵州医科大学实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK(渝) 2007－0005。大耳白兔饲养在SPF级动物室中，室温(22 ±2)℃、湿度(50±10) %、换气次数≥14次/h、人工照明12 h，分笼饲养;每只白兔每天供应标准颗粒饲料350 g，自由饮用流动自来水。动物实验方案获得贵州医科大学动物实验伦理委员会的审查批准，45只兔随机分为对照组、实验A、B、C及D组，每组9只。

1.2方法

1.2.1下颌骨牵张成骨模型实验动物取仰卧位，四肢固定于手术台上，3%戊巴比妥钠按1 mL/ kg体质量静脉麻醉，手术区剪毛后碘伏消毒手术区皮肤，做平行于下颌骨下缘长约2.5 cm切口，切开皮肤及皮下组织，分离肌肉及骨膜，沿骨面剥离显露下颌骨外侧面。在前牙后方与第1磨牙前方交界处，以慢速裂钻作垂直于下颌骨下缘的截骨线，将牵张器(浙江宁波慈北医疗器械有限公司)放置于骨面，方向与下颌骨下缘平行并固定;生理盐水冲洗手术野，充分止血后分层严密缝合切口。术后第6天开始牵张延长下颌骨，牵张速度为1 mm/d，2次/d，0.5 mm/次，牵张10 d后进入固定期。

1.2.2新骨组织标本的获取对照组隔日皮下注射生理盐水1 mL。实验A、B、C及D组分别按兔体质量隔日皮下注射10、20、30及40 μg/kg的rhPTH。rhPTH购自上海近岸生物科技公司。各组实验动物在固定期第1天、第7天和第14天时麻醉后分别处死3只，完整取出牵张侧下颌骨，以4%多聚甲醛固定。

1.2.3骨密度测定骨密度(Bone mineral Density，BMD)测定采用美国GE公司生产的LUNAR DPX双能X线骨密度测定仪(工作电压87 kV，工作电流0.8～2.5 mA;笔束式扫描，束点大小1.2 mm×1.2 mm)。测定BMD部位为两侧骨断端之间新骨区域，以数字式放射吸收测量法测定新骨区域的骨密度。

1.2.4新骨的组织形态学观察及计量学分析新骨组织形态学观察:截取缺损区的新骨标本，EDTA脱钙液脱钙2周，系列酒精脱水，二甲苯透明、石蜡包埋，横断面切片，片厚5 μm;常规HE染色，光学显微镜下观察牵张区新骨组织形态学变化。新骨组织形态计量学分析:采集HE切片图象并输入图像处理分析系统(HMIAS-2000W High definition color graphic analysis management system of medicine，Wuhan Champion Image Technology Company，China)，每例HE切片随机选取5个视场，在200倍光学显微镜下，自动计数成骨细胞数量;在100倍光学显微镜下，用自动测量法测量骨小梁面积。

1.3统计学分析

2　结果

2.1 BMD

各组实验动物下颌骨均成功延长10 mm，牵张间隙内均可见新骨组织生成(图1)。在固定期第1天、第7天和第14天时，各实验组平均BMD均高于对照组，实验组和对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05) ;随固定期延长，各组牵张区新骨BMD逐渐升高。在各固定期C组骨密度最高，与B组、A组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，但C组和D组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

图1　牵张延长后兔下颌骨Fig.1　Gross view of rabbit mandible after distraction osteogenesis

2.2新骨组织形态学观察

固定期第1天，对照组牵张间隙内主要以大量的纤维结缔组织为主，可见稀疏的幼稚骨小梁生长，排列紊乱，连续性差，骨小梁周围可见成骨细胞聚集;实验组牵张间隙内基质分泌旺盛，有连续性较好的骨小梁生长，排列方向规则并出现部分钙化，密集程度高于对照组，并可见到成骨细胞在骨小梁周围带状聚集。固定期第7天，各组新骨的骨小梁周围都有明显的成骨细胞带状聚集;对照组骨小梁方向规则，可见少量连续的新生骨小梁，但骨小梁间隙较大(图2) ;各实验组新骨区有部分骨小梁连接融合，骨小梁更加成熟;实验C组和D组骨小梁的宽度较大，骨小梁相互连接融合形成大片的编织骨(图2)。固定期第14天，各实验组可见大量密度均匀的岛状新生骨组织形成，骨小梁宽大，并相互连接融合，可见到明显的血管生成;实验组和对照组成骨活跃，骨小梁边缘均可见成骨细胞带状排列，但实验组新骨骨基质的钙化均匀程度和密集程度都明显高于对照组。

表1　各组实验动物牵张区新骨平均BMD(g/cm2，±s) Tab.1　Measurements of the average BMD for new bone in the distraction area for each group

表1　各组实验动物牵张区新骨平均BMD(g/cm2，±s) Tab.1　Measurements of the average BMD for new bone in the distraction area for each group

(1)与对照组比较，P＜0.05;(2)与A组比较，P＜0.05;(3)与B组比较，P＜0.05

组别　　下颌骨牵张成骨模型固定期BMD 第1天　　第7天　　第14天对照组0.054±0.008　0.083±0.003　0.174±0.006 A组　0.112±0.003(1)　0.143±0.001(1)　0.202±0.010(1)B组　0.141±0.011(1) (2)　0.166±0.007(1) (2)　0.228±0.010(1) (2)C组　0.173±0.016(1) (2) (3)　0.198±0.018(1) (2) (3)　0.295±0.014(1) (2) (3)D组　0.163±0.008(1) (2) (3)　0.187±0.003(1) (2) (3)　0.275±0.008(1) (2) (3)

图2　固定1周时新骨组织形态学结果Fig.2　Histomorphological results on day 7 of the consolidation period after the end of distraction

2.3新骨组织计量学结果

2.3.1骨小梁面积在固定期第1天、第7天和第14天时，各实验组平均骨小梁面积均大于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05) ;随固定期延长，各组新骨骨小梁面积逐渐增大，实验C组骨小梁面积最大，其次是D组，但这两组骨小梁面积比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2　各组实验动物牵张区新骨平均骨小梁面积(mm2，±s) Tab.2　Measurements of the average trabecular area for new bone in the distraction area for each group

表2　各组实验动物牵张区新骨平均骨小梁面积(mm2，±s) Tab.2　Measurements of the average trabecular area for new bone in the distraction area for each group

(1)与对照组比较，P＜0.05;(2)与A组比较，P＜0.05;(3)与B组比较，P＜0.05

组别　下颌骨牵张成骨模型固定期骨小梁面积第1天　　第7天　　第14天对照组0.968±0.012　1.308±0.012　1.515±0.041 A组　1.271±0.002(1)　1.634±0.005(1)　1.789±0.007(1)B组　1.508±0.009(1) (2)　1.636±0.007(1)　1.851±0.005(1) (2)C组　1.637±0.005(1) (2) (3)　1.820±0.006(1) (2) (3)　2.070±0.022(1) (2) (3)D组　1.621±0.005(1) (2) (3)　1.752±0.015(1) (2) (3)　2.051±0.088(1) (2) (3)

2.3.2成骨细胞数计数在固定期第1天、第7天和第14天时，各实验组平均成骨细胞数均高于对照组，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。牵张第1天时，C组成骨细胞数量最高，其次为D组;随固定期延长，各组成骨细胞数量逐渐减少。牵张第1天时，B组和A组成骨细胞数量比较差异无统计学意义(P＞0.05) ;固定期第7天时，B、C、D组成骨细胞数量较高，与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05) ;固定期第14天时，C组高于B组和D组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3　各组实验动物牵张区新骨成骨细胞数计数结果(个，±s)Tab.3　Counts of osteoblasts in new bone in the distraction area for each group

表3　各组实验动物牵张区新骨成骨细胞数计数结果(个，±s)Tab.3　Counts of osteoblasts in new bone in the distraction area for each group

(1)与对照组比较，P＜0.05;(2)与A组比较，P＜0.05;(3)与B组比较，P＜0.05;(4)与C组比较，P＜0.05

组别　下颌骨牵张成骨模型固定期成骨细胞数第1天　　第7天　　第14天对照组59.2±3.7　55.2±3.1　 40.2±2.2 A组　72.6±3.4(1)　63.4±3.8(1)　47.4±6.4(1)B组　72.8±4.5(1)　65.8±4.1(1) (2)　49.6±2.7(1) (2)C组　77.2±3.6(1) (2) (3)　72.6±2.7(1) (2) (3)50.4±2.7(1) (2)D组　75.2±4.8(1) (2) (3) (4)72.4±5.3(1) (2) (3)49.6±3.0(1) (2)

3　讨论

牵张成骨技术为颌面部发育不足和获得性骨缺损畸形提供了一种有效增加骨量的技术手段，已被广泛运用于颌面外科整复领域。但牵张延长的新骨需要较长时间矿化改建才能行使生理功能，因而如何加速牵张区新骨的形成，缩短治疗时间一直是研究热点问题。PTH是甲状旁腺主细胞分泌的多肽，是调节人体钙磷内环境稳定的重要激素，对调节骨代谢具有双重效应。rhPTH商品名为特立帕肽，已应用于治疗绝经后骨质疏松症患者及促进骨折愈合［1－3］。研究发现PTH影响骨骼代谢主要依赖于PTH给予剂量和方式，持续高剂量的给予PTH能增加骨吸收，而间断性小剂量应用PTH具有成骨效能［4－8］。既往研究显示［9－13］，在牵张成骨期间，间隙性皮下注射PTH可使牵张区新骨骨密度和骨矿化浓度增加，骨小梁数量明显增多，提高新骨矿化成熟速度和生物力学性能。在颅颌面骨研究方面发现，间断性应用PTH可促进颅骨、下颌骨骨矿化沉积、牙槽嵴骨形成和下颌骨骨折愈合［8，14－17］。本研究通过建立兔下颌骨牵张成骨实验动物模型，在牵张期间断性皮下注射不同剂量PTH，应用骨密度测定和形态计量学观察分析PTH对牵张区新骨形成的影响，结果显示应用PTH后各实验组骨小梁的厚度、面积和骨密度均高于对照组，说明应用PTH可加速下颌骨牵张区新骨的形成和矿化。

Seebach［13］等研究显示，在大鼠股骨牵张延长期间，间断性给予PTH 60 mg/kg可提高新骨机械强度和生物力学性能。Aleksyniene等［9－11］的研究显示25 μg/(kg·d)和5 μg/(kg·d)两种剂量PTH均可提高兔胫骨牵张区新骨矿化程度，但同时发现25 μg(kg·d)皮下注射对新骨的矿化程度更有效。Ali等［12］通过建立大鼠下颌牵张成骨模型，每周3次皮下注射PTH 60 μg/kg，作牵张区新骨Micro CT检测，结果显示应用PTH组牵张区新骨平均骨容量大于对照组。有研究显示绝经后骨折患者分别注射特立帕肽40 μg/d和20 μg/d，两组在缩短骨折愈合时间上无统计学差异，但注射20 μg/d特立帕肽缩短骨折愈合时间明显优于对照组。本研究将rhPTH给予剂量分为4组，各实验组固定期第1、7、14天时新骨平均骨密度高于对照组。给予rhPTH的实验组动物牵张区骨性骨痂与骨样组织的矿化出现时间早于对照组，同时各个时期骨小梁面积和新骨成熟程度均优于对照组。而在30 μg /kg组中骨密度在各时间段最高，骨钙沉积作用更快速，说明隔日皮下注射PTH 30 μg /kg促进兔下颌骨牵张成骨效应更好。

骨合成代谢依赖成骨细胞的参与，新骨生成速度与成骨细胞的功能活性状态密切相关。外源性小剂量PTH间断给予后，可能通过刺激骨髓微环境中成骨活性基因表达，增加成骨细胞数量，延缓成骨细胞凋亡而延长其寿命，从而促进骨合成代谢［18－19］。唐正龙等［20］在应用PTH促进下颌骨缺损修复的研究中发现，PTH可通过增加成骨细胞数量并加速骨转换代谢而发挥促进颌骨缺损修复。本实验研究发现在固定期第1、7、14天时各实验组成骨细胞数高于对照组，提示间断性低剂量应用rhPTH可促进成颌骨牵张成骨过程中成骨细胞的分化，推测PTH对颌骨牵张成骨的促进作用是通过有效增加新骨区成骨细胞数并促进其矿化过程而实现的。

综上，外源性应用rhPTH可能通过某种信号途径刺激成骨细胞活性，增加成骨细胞的数量，同时促进新骨骨小梁的形成和钙化，从而加速新骨形成质量。本研究观察时间在骨生长活动最活跃的牵张结束到固定期2周内，研究结果仅反映了PTH促进下颌骨牵张成骨的早期调控阶段。同时由于剂量分组较少，且观察时间较短，尚不能得出加速下颌骨牵张成骨的最适宜PTH给予剂量。

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(2015－12－09收稿，2016－01－30修回)

中文编辑:吴昌学;英文编辑:刘华

The Influence of Different Doses of Parathyroid Hormone on Differences of New Bone Formation During Mandibular Distraction Osteogenesis

BAI Shuo1，2，WANG Dongxiang1，ZHU Pengna1，TANG Zhenglong1
(1.Department of Oral＆Maxillofacial Surgery，the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China; 2.Stomatological Hospital，Hangzhou 310000，Zhejiang，China)

［Abstract］Objective: To investigate the effects of parathyroid hormone (PTH) on new bone formation during mandibular distraction osteogenesis (DO).Methods: Forty-five Japnese rabbits were divided into control group，receiving a subcutaneous injection of 1 ml of saline every other day and experimental groups A，B，C and D，receiving subcutaneous injections of 10，20，30 and 40 μg/kg of rhPTH，respectively，every other day.On the 1(st)，7(th)，14(th)day of the consolidation period after the mandibular distraction had been completed，new bone in the distraction region was examined through histomorphometric investigation and bone mineral density (BMD) was detected.Results: On the 1(st)，7(th)，14(th)day of the fixation period，number of osteoblasts，trabecular bone area and BMD were significantly greater in each experimental group than their counterparts in control group (P＜0.05).On 1st day of the consolidation period，the average gnumber of osteoblasts and BMD in group C were highest.With the fixation period to extend，in each experimental group，BMD of new bone and trabecular bone area increased gradually while number of osteoblasts decreased.Conclusions: Intermittent subcutaneous injections of rhPTH can promote new bone formation during mandibular DO.Different doses of rhPTH can promote mandibular DO and there may exist differences in dose effect.

［Key words］recombinant human parathyroid hormone; distraction osteogenesis; mandible; bone mineral density; osteoblast

*［基金项目］国家自然科学基金(No: 81160130)

［中图分类号］R782.05

［文献标识码］A

［文章编号］1000-2707(2016) 02-0145-05