党参水提物对D—半乳糖致衰老小鼠肾组织microRNA表达谱的影响

王晶 黄勇 李海龙 林志艳 田一虹 陈彻

摘要：目的 观察党参水提物对衰老模型小鼠肾组织microRNA（miRNA）表达谱的影响，探讨党参抗衰老的分子机制。方法 采用皮下注射D-半乳糖溶液制造衰老模型。将100只昆明种小鼠随机分为正常组、模型组和党参低、中、高剂量组，每组20只。党参各组给予相应剂量党参水煎液灌胃干预，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，连续42 d。生化分析仪测定小鼠血清尿素（BUN）和肌酐（CREA）含量；利用AffymetrixmiRNA 4.0微阵列芯片筛选D-半乳糖致小鼠衰老和党参干预衰老过程中差异表达的miRNA，并利用生物信息学工具对芯片结果进行聚类及信号通路分析。结果 与正常组比较，模型组小鼠血清BUN和CREA含量显著升高（P<0.05）；与模型组比较，党参各剂量组小鼠血清BUN和CREA含量呈下降趋势，其中党参高剂量组BUN下降较显著（P<0.05）；芯片聚类分析显示，模型组miRNA表达谱与正常组和党参高剂量组明显分开，而党参高剂量组和正常组miRNA表达谱聚在一起；另外，模型组比正常组有36个差异表达miRNA，其靶基因参与到10个主要的生物学功能中；党参高剂量组比模型组有34个差异表达miRNA，其靶基因的生物学功能分析与模型组比正常组的分析结果相同。结论 在抗衰老过程中，党参不仅影响了miRNA表达谱的变化，也影响了其作用的功能环境。

关键词：党参；抗衰老药；microRNA表达谱；芯片；小鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）05-0069-04

Effects of Aqueous Extracts of Codonopsis Radix on MicroRNA Expression Profiling of D-galactose Induced Kidney of Aging Mice WANG Jing1， HUANG Yong1， LI Hai-long2， LIN Zhi-yan1， TIAN Yi-hong1， CHEN Che1 （1. School of Medical Examination， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Laboratory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To explore the effects of aqueous extracts of Codonopsis Radix on D-galactose induced aging model mice； To discuss the anti-aging molecular mechanism of Codonopsis Radix. Methods Subcutaneous injection of D-galactose solution was used to establish aging models. 100 Kunming mice were divided into normal control group， model group and low-， medium-， high-dose of Codonopsis Radix interventional groups randomly， 20 mice in each group. Low-， medium-， high-dose of Codonopsis Radix interventional groups were given relevant dosage for gavage， while normal control group and model group were given the same volume of NS by gavage for 42 d. After treatment for 42 days， the BUN and CREA in mouse serum were examined； the AffymetrixmiRNA 4.0 microarray was employed to identify the differentially expressed microRNA （miRNA） related with these processes； the bioinformatic tools were also used to further analyze the cluster of miRNA microarrys and the pathways which the target genes of miRNA were involved in. Results Compared with normal control group， the levels of BUN and CREA in mouse serum increased in model group （P<0.05）； compared with model group， the levels of BUN and CREA in Low-， medium-， high-dose of Codonopsis Radix interventional groups decreased， in which high-dose of Codonopsis

基金项目：甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室开放基金项目（ZYFYZH-KJ-2015-008）；甘肃省高等学校科研项目（2013A-087）

通讯作者：陈彻，E-mail：Chen72123@163.com

Radix could most significantly inhibit the level of BUN （P<0.05）； the cluster analysis showed the miRNA expression profilings of high dose of Codonopsis Radix interventional group and normal control group were brought together， while the profiling of model group was clearly divided with the other groups. In model group vers normal control group， 36 differentiated expressed miRNA showed， which predicated in 10 main biological functions. In high-dose of Codonopsis Radix interventional group vers model group， 34 differentiated expressed miRNAs in high-dose of Codonopsis Radix interventional group showed， and the analytical results of biological functions of target genes were the same as those of model group vers normal control group. Conclusion In the anti-aging process， Codonopsis Radix can not only influence the miRNA expression profiling， but also influence its functional environment.

Key words： Codonopsis Radix； anti-aging medicine； microRNA expression profiling； microarray； mice

党参具有补益精气、养血生津之效，是传统的补气中药。有研究显示，党参提取物可以延缓衰老[1]。目前，有关党参抗衰老机制研究，主要在某一方面或某一层次上分析党参抗衰老的作用机制[2]，但中药的特点在于成分复杂、靶点多、作用层次广，所以很多有用信息被遗漏。microRNA（miRNA）是一类在人类发育、衰老和肿瘤中起基因表达调控作用的非编码小RNAs，是近年来生命医学领域的研究热点[3]。因此，本研究利用生物芯片和生物信息学工具分析党参水提物对D-半乳糖致衰老小鼠肾组织miRNA表达谱的影响，并进行miRNA靶基因功能分析，拟从miRNA组学水平探讨党参抗衰老作用的机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级昆明种小鼠100只，2月龄，雌雄各半，体质量（18±2）g，甘肃中医药大学科研实验动物中心，合格证号SCXK（甘）2011-0001。室温20～25 ℃，自由饮水、摄食，自然光照。

1.2 药物及制备

党参，采自甘肃岷县，经甘肃中医药大学中药资源教研室杜弢教授鉴定为白条党参。取党参100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并2次提取液，过滤，浓缩成含原药材0.5 g/mL的水煎剂，置4 ℃冰箱保存备用，水煎液每5 d制备1次。

1.3 主要试剂与仪器

D-半乳糖，美国Sigma公司，批号24895207，临用前用生理盐水配制成12 g/L备用。尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）检测试剂盒，上海酶联生物有限公司，批号分别为ml016913、ml016916。BS224S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；XYJ80-20型离心机，金坛市恒丰仪器厂；7020-020型全自动生化分析仪，日立公司；GeneChip? Scanner 3000激光扫描仪，美国Affymetrix公司。

2 实验方法

2.1 造模及分组

采用颈背部皮下注射D-半乳糖溶液制作衰老模型，给药剂量为每日每只小鼠50 g/L D-半乳糖溶液，注射量为0.025 mL/g。将100只小鼠随机分为正常组、模型组和党参低、中、高剂量组，每组20只，雌雄各半。党参低、中、高剂量组予5、10、15 g /kg党参溶液灌胃，正常组和模型组予等量生理盐水灌胃，连续42 d。

2.2 生化指标测定

小鼠处死前，先尾静脉取血1 mL，3000 r/min离心10 min，分离血清，用生化分析仪测定BUN和CREA含量。

2.3 miRNA芯片检测

利用液氮和Trizol提取各组小鼠肾组织总RNA，采用AffymetrixmiRNA 4.0微阵列芯片（北京国家工程研究中心提供），共有探针数目30 424条（包含所有物种）进行检测分析。整个实验过程严格按照博奥AffymetrixmiRNA 4.0微阵列芯片实验指南进行。杂交完成的芯片采用扫描仪进行扫描，再用Affymetrix? GeneChip?Command Console?Software对扫描得到的芯片图像进行分析，经过归一化和“坏点”剔除，选择荧光信号值≥1000，Cy5/Cy3≥2.0或≤0.5的miRNA为表达差异miRNA。

2.4 生物信息学分析

利用Cluter V3.0对芯片数据进行聚类分析；采用Argonaute数据库（该数据库收录的miRNA靶基因是已被文献报道和实验证实过的）分析差异表达miRNA的靶基因[4]，在此基础上利用博奥晶芯生物分子功能注释系MAS V4.0（http：//bioinfo.capitalbio. com/mas/）和KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）数据库，分析miRNA靶基因所参与的信号通路[5]。

3 统计学方法

采用Excel 2007软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 党参对模型小鼠肾功能的影响

造模4周后，模型小鼠开始出现精神萎靡、皮毛疏松欠光泽等衰老症状。与正常组比较，模型组小鼠BUN和CREA含量明显升高（P<0.05）；党参各剂量组小鼠血清BUN和CREA含量较模型组均有下降趋势，其中党参高剂量组BUN下降明显（P<0.05）。结果见表1。

4.2 党参对模型小鼠肾组织miRNA表达谱的影响

提取正常组、模型组和党参高剂量组小鼠肾组织总RNA，其纯度符合正常范围值（OD260/OD280>1.9，OD260/OD230>2.0），浓度为1.057、1.194、0.951 μg/μL。RNA纯化后质检结果见图1，28 s、18 s和5 s条带较清晰，总RNA纯度和质量较好，适宜进行miRNA表达谱检测。

通过芯片检测，每个样本分别检测到1909个小鼠miRNA探针信号值，将所检测到的数据做聚类分析，发现模型组和正常组miRNA表达谱被明显分开，而党参高剂量组与正常组miRNA表达谱聚类在一起。芯片结果显示，一些在模型组比正常组中表达上调的miRNA，在党参干预后表达明显下调；而其中表达下调的miRNA，在党参干预后表达明显上调。见表2、图2。

4.3 党参对模型小鼠肾组织miRNA靶基因信号通路的影响

利用Argonaute数据库，发现模型组比正常组中有36个差异表达miRNA与89个基因存在潜在的调控关系，通过MAS分析工具，发现这些miRNA靶基因参与到45条KEGG信号通路中（P<0.001），根据P值排序，将前20条信号通路整理，见表3。根据KEGG功能分类[5]，这些显著富集的信号通路可归为10个功能类别，见图3。分析党参高剂量组比模型组差异表达miRNA靶基因的信号通路，其结果与模型组比正常组的分析结果完全重合。

5 讨论

本研究从miRNA入手，研究这一过程中miRNA表达谱的变化及其所涉及的调控关系。芯片聚类结果显示，党参的确干预了D-半乳糖诱导的衰老。而且，模型组比正常组中大多数差异表达miRNA，在党参干预后表达模式发生了相反的调控变化。其中发生表达调控变化的miRNA有miR-494、miR-29b、miR-203、miR423、miR-125a、miR-466f和miR-138等，这些miRNA可能是党参干预衰老过程的潜在靶点，在该过程中发挥着重要的功能。

利用Argonaute数据库，本研究发现许多miRNA的靶基因都是调控个体生长发育的重要分子，如miR-205和PTEN/SATB2/Runx2，miR-494和FGFR2/LIF，miR203和E2F3，miR466和PROX1。通过KEGG数据库分析，miRNA靶基因参与的通路可划分为不同的生物学功能类别。其中，肿瘤、信号传导、免疫系统，以及细胞的生长和死亡等生物功能在所有分析结果中占主要比例。而且，有趣的是党参高剂量组比模型组和模型组比正常组的功能分析结果完全一致。这说明在党参抗衰老过程中，miRNA与靶基因的调控关系和其功能环境密切联系，即当一个miRNA的表达被上调（或下调），其所调控靶基因的表达就会下调（或上调），该基因所参与的功能信号通路也受到调控。因此，在抗衰老过程中，党参不仅影响miRNA表达谱的变化，也影响其作用的功能环境。

综上，本研究利用高通量表达谱筛选了与D-半乳糖致小鼠衰老和党参水提物抗衰老相关的差异表达miRNA，并结合生物信息学工具分析了miRNA在此过程中参与调控的生物学功能，为揭示党参抗衰老机制提供了重要资料。

参考文献：

[1] 耿广琴，杨雅丽，王晶，等.党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝肾SOD活性、MDA含量及超微结构的影响[J].中医研究，2014，27（7）：70-74.

[2] 郭美，刘丽莎，何敏，等.党参抗衰老作用的研究进展[J].中国老年学杂志，2013，33（5）：1205-1207.

[3] LOPEZ-OTIN C， BLASCO M A， PARTRIDGE L， et al. The hallmarks of aging[J]. Cell，2013，153（6）：1194-1217.

[4] SHAHI P， LOUKIANIOUK S， BOHNE-LANG A， et al. Argonaute-a database for gene regulation by mammalian microRNAs[J]. Nucleic Acids Res，2006，34：115-118.

[5] WANG J， XIANG G X， MITCHELSON K， et al. Microarray profiling of monocytic differentiation reveals miRNA-mRNA intrinsic correlation[J]. J Cell Biochem，2011，112（9）：2443-2453.