参芪益智颗粒对5XFAD转基因小鼠学习记忆能力和脑内β淀粉样蛋白1—42含量的影响

钱燕静 甄军丽 卫东锋 郑焱 王晓民

摘要：目的 观察参芪益智颗粒对阿尔茨海默病5XFAD转基因小鼠行为学和脑组织β淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）含量的影响，探讨其改善5XFAD小鼠学习记忆能力的作用机制。方法 将4月龄C57BL?6野生型小鼠随机分为生理盐水对照组和中药对照组，同时将同月龄5XFAD小鼠随机分为模型组、参芪益智颗粒组和石杉碱甲组，每组15只，各给药组给予相应药物灌胃，连续60 d。给药结束后，采用筑巢实验、避暗实验和Morris水迷宫实验评价各组小鼠学习和记忆能力；免疫组化和免疫荧光方法观察各组小鼠皮层和海马组织老年斑块、Aβ1-42、小胶质细胞激活的标记物小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白1及星形胶质细胞激活标记物胶质纤维酸性蛋白含量的变化。结果 与生理盐水对照组比较，模型组小鼠筑巢实验得分明显降低，避暗实验步入潜入期明显缩短，水迷宫实验逃避潜伏期明显延长，脑内老年斑块明显增多，Aβ1-42含量明显升高，胶质细胞激活明显增强。参芪益智颗粒组小鼠上述指标均恢复或接近至野生型小鼠水平，与模型组小鼠比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结论 参芪益智颗粒改善5XFAD小鼠学习和记忆能力的机制与减少脑内老年斑数量、抑制胶质细胞过度激活、减少脑内Aβ1-42的含量有关。

关键词：参芪益智颗粒；阿尔茨海默病；5XFAD转基因小鼠；学习和记忆；β淀粉样蛋白；神经胶质细胞

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）05-0051-06

Effects of Shenqi Yizhi Granules on Ability of Learning and Memory and Content of Aβ1-42 of Cerebral Tissue in 5XFAD Mice with Alzheimers Disease QIAN Yan-jing1，2， ZHEN Jun-li1，2， WEI Dong-feng3， ZHENG Yan1，2， WANG Xiao-min1，2 （1. Department of Neurobiology， Key Laboratory for Neurodegenerative Disorders of the Ministry of Education， College of Basic Medicine of Capital Medical University， Beijing 100069， China； 2. Beijing Institute for Brain Disorders， Beijing 100069， China； 3. Institute of Basic Research in Clinical Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

Abstract： Objective To study the effects of Shenqi Yizhi Granules （SQYZ） on learning and memory and content of Aβ1-42 of cerebral tissue in 5XFAD mice with Alzheimers disease； To discuss its mechanism on improving learning and memory ability of 5XFAD mice. Methods Four-month-old C57BL?6 wild type mice were randomly divided into NS control group and SQYZ control group， and the 5XFAD mice were randomly divided into model group， SQYZ group and huperzine-A （HupA） group， 15 mice in each group. Each group were given same volume for gavage for 60 d. After treatment， the learning and memory ability were evaluated by nesting test， passive avoidance and Morris water maze test. The senile plaques and content of Aβ1-42， ionized calcium binding adapter molecule 1 and glial fibrillary acidic protein in cerebral cortex and hippocampus were detected by immunohistochemical staining and immunofluorescence， respectively. Results Compared with NS control group， the score of nesting test in model group significantly decreased； the step-through latency in passive avoidance was shortened and the escape latentcy in Morris water maze test was prolonged； the quantity of senile plaques and content of Aβ1-42 increased in cerebral cortex and hippocampus； the activation of glial cells significantly increased. In the SQYZ group， the above-mentioned indexes

基金项目：国家自然科学基金（81571038）；北京市属高等学校创新团队建设与教师职业发展计划项目（IDHT20140514）

通讯作者：王晓民，E-mail：xmwang@ccmu.edu.cn

reached or approached the level of wild type control mice. The difference between SQYZ group and model group was statistically significant （P<0.05， P<0.01）. Conclusion SQYZ improved learning and memory ability in 5XFAD mice， which may be related to reduction of senile plaques， inhibition of over activation in glial cells and reduction of content of Aβ1-42 in cerebral cortex and hippocampus.

Key words： Shenqi Yizhi Granules； Alzheimer's disease； 5XFAD transgenic mice； learning and memory； Aβ1-42； glial cells

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种起病隐匿、以逐渐恶化性智能衰退为特征的神经退行性疾病，其主要临床症状为进行性认知功能损害和精神行为异常[1]。随着老龄化社会的到来，AD发病率逐渐上升，到2030年全世界的AD患者将达6500万，给患者家庭和社会带来沉重负担[2]。AD患者大脑皮质和海马是最常受损的脑区，病理改变主要表现为淀粉样老年斑（senile plaque，SP），其中以β淀粉样蛋白（Aβ）蛋白沉积学说较为重要[3-4]。目前，临床治疗AD的药物如盐酸美金刚和盐酸多奈哌齐等均为单一作用靶点，常伴有明显不良反应。AD属中医学“痴呆”范畴，为本虚标实之证，王永炎教授等认为“气虚-血瘀-痰瘀-酿毒-病络”为AD早期的核心病机，其中气血亏虚是AD早期发生的前提条件，痰浊血瘀是引起AD的病理因素，毒损脑络和病络是早期AD发生的病机核心，使髓减脑消、神机失用，日久发为呆病。因此，针对以上病机，中医临床防治AD以益气健脾、活血化瘀治其本，化痰清浊、解毒通络、醒脑开窍治其标，使气血充足、脑髓充盈、神机复用[5]。传统中药在改善AD患者认知功能方面具有悠久的历史，积累了丰富的临床实践经验，具有一定的潜在优势和研发价值。参芪益智颗粒是总结王永炎教授长期临床经验的基础上提炼出来的治疗AD的经验方，由黄芪、人参、黄芩等中药组成，具有益气健脾、活血化瘀、安神益智、解毒通络之功效。本实验以5XFAD转基因小鼠为AD动物模型，采用筑巢实验、避暗实验、Morris水迷宫实验、免疫组化及免疫荧光方法观察参芪益智颗粒对5XFAD小鼠行为学和脑组织中SP、Aβ1-42、小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白1（Iba1）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）含量的影响，探讨参芪益智颗粒改善5XFAD小鼠学习记忆能力的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

5XFAD杂合体双转基因小鼠[含突变的APP基因（Swedish K670N和M671L；Florida I716V；London V717I）和早老素1基因（M146L和L286V）]源自美国Jackson实验室，首都医科大学动物实验中心使用4月龄C57BL?6野生型小鼠30只（北京维通利华实验动物技术有限公司）进行繁殖并鉴定。4月龄转基因小鼠50只、雌雄各半，体质量（22±3）g，SPF级环境饲养，温度（22±2）℃，相对湿度（55±5）%，分笼喂养，明暗交替12 h/12 h，自由摄食、饮水。

1.2 药物

参芪益智颗粒提取液由中国中医科学院中药研究所提供，药物浓度为2.24 g原药材/mL（批号20140508），4 ℃保存备用。石杉碱甲（HupA，北京世纪奥科生物有限公司，批号MUST-13102808）。

1.3 主要试剂与仪器

小鼠抗小鼠Aβ为6E10，Covance公司，批号SIG-39300；兔抗小鼠Iba1，Wako公司，批号019-19741；兔抗小鼠GFAP，Millipore公司，批号MAB360；免疫组化Mouse ABC试剂盒（批号PK4002）、Rabbit ABC试剂盒（批号PK4001），Vector labs公司；DAB染色试剂盒（批号ZLI-9019）、488标记羊抗兔荧光二抗（批号ZF-0511）、594标记羊抗兔荧光二抗（批号ZF-0516），北京中杉金桥生物技术有限公司；Aβ1-42 ELISA试剂盒，美国Invitrogen公司，批号KHB3441。Morris水迷宫系统和视频分析软件（美国Actimetrics公司），穿梭避暗实验箱（安徽正华生物仪器设备公司）。

1.4 分组及给药

根据基因鉴定结果将小鼠按基因型分为野生型对照组（wild-type group，WT组）和转基因模型组（trangenic group，Tg组）。实验共分5组，野生型对照组随机分为生理盐水对照组（WT+NS组）和中药对照组（WT+SQYZ组），Tg组随机分为模型组（Tg+NS组）、参芪益智颗粒组（Tg+SQYZ组）及石杉碱甲组（Tg+HupA组），每组15只，雌雄各半。按药物临床使用剂量通过体表面积换算为小鼠给药剂量，即参芪益智颗粒给药剂量为5.55 g原药材/（kg·d），石杉碱甲给药剂量为0.1 mg/（kg·d）。WT+NS组和Tg+NS组灌服等量生理盐水，每日1次，连续60 d。给药结束后进行行为学检测和病理观察。

1.5 行为学检测

1.5.1 筑巢实验 该实验用于检测小鼠的自主行为和社交能力。首先将小鼠单笼放置，适应环境24 h 后，每笼中放入厚度为1 cm 的垫料，夜节律前2 h均匀平铺放入剪裁大小一致的正方形无味薄纸巾片8份（每份含4张，每张边长约4.5 cm），24 h后按照文献[6]改良的4分法对筑巢质量进行评分：纸片杂乱散布在笼子各处，未被撕咬得1分；纸片被聚到笼子的一侧，但较松散，无成型的巢，无明显的撕咬或折叠得2分；纸片聚拢折叠呈成型但较平的巢，无明显撕咬得3分；纸片聚拢折叠成较深的巢，并被撕咬成小块得4分。

1.5.2 避暗实验 该实验用于检测动物的条件学习记忆功能。①记忆获取：将动物放在明室离门最远处，背向洞口置于明室，记录动物第1次进入暗室的时间（即步入潜伏期），动物进入暗室后对动物足底进行间断的电刺激（50 Hz，36 V，1 s），5 min 后取出动物，放回笼中。②记忆测试：于24 h 后暗室内不给予电刺激，余条件同前，记录小鼠5 min内进入暗室的错误次数、第1次进入暗室的步入潜伏期和5 min内在明室内的总时间[7]。

1.5.3 Morris水迷宫实验 该实验用于评价动物的空间学习和记忆能力。将水池随机分为4个象限，实验时平台位置固定不变，置于第2象限中央，低于水面1～2 cm。实验前1 d为适应及可视平台阶段，观察其视觉及运动能力有无异常，对有异常的小鼠予以剔除。进行定位航行实验时，平台位于水面下1 cm，除平台所在象限外的其他3个象限为入水点，该实验历时5 d，每日上下午各进行1次。将小鼠随机从除平台外的3个象限轻轻地面朝壁式入水，记录60 s内找到平台的时间（逃避潜伏期），并让其在平台上停留30 s。若小鼠60 s内未找到平台，则潜伏期记为60 s。定位航行实验结束后24 h，进行空间探索实验，将水中平台去除，选择同一象限将小鼠头朝池壁放入水中，记录小鼠60 s内穿越平台所在象限的时间百分比。

1.6 脑组织检测

小鼠腹腔注射6%水合氯醛麻醉，剖开胸腔暴露心脏，经左心室灌流37 ℃生理盐水50 mL。打开颅骨取出脑组织，一分为二，左侧半球置于4%多聚甲醛后固定24 h，经20%、30%蔗糖溶液梯度脱水，OCT固定包埋，切片（厚度30 μm），并置于切片防冻液中备用。同时，将右侧半球快速分离出皮层和海马组织，经液氮快速冷冻后，-80 ℃冰箱冻存备用。

1.6.1 脑组织老年斑检测 0.01 mol/L PBS洗涤脑片5 min×3次，3%H2O2室温孵育30 min，再0.01 mol/L PBS洗涤5 min×3次；用与二抗来源一致的封闭血清室温孵育1 h；滴加相应比例稀释（1∶1000）的特异性一抗6E10，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次；加入二抗工作液，37 ℃孵育1 h；PBS洗涤3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；PBS洗涤3次；DAB显色（避光）1 min，PBS终止反应；贴片后自然晾干，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.6.2 皮层和海马组织小胶质细胞和星形胶质细胞检测 采用Iba1、GFAP抗体分别检测小胶质细胞和星形胶质细胞数量的变化。将脑片浸入0.01 mol/L PBS中洗涤5 min×3次，0.3%Trition透膜30 min，再在0.01 mol/L PBS洗涤5 min×3次；用与二抗来源一致的封闭血清室温孵育1 h；滴加相应比例稀释的特异性一抗Iba1（1∶200）和GFAP（1∶500），4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次后，加入相应的荧光二抗工作液（避光）1 h，PBS洗涤后，贴片自然晾干，滴加封片剂，荧光显微镜下观察。

1.6.3 皮层和海马组织β淀粉样蛋白1-42含量的测定 根据试剂盒说明书配制标准品和检测剂工作液，样品稀释液与标准品稀释液一致；将标准品和样品依次加入孔板中（样品设复孔），每孔50 L，加入待测Aβ1-42抗体50 L，室温孵育3 h；洗板5次，加入100 L HRP偶联二抗，室温30 min；洗板5次，加入100 L Stabilized Chromogen（避光），室温30 min，加入终止液；采用酶标仪读板（检测波长450 nm，参考波长570 nm），根据标准曲线显示出待测样品浓度，再乘以稀释倍数即为原始浓度。

1.7 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。水迷宫实验逃避潜伏期应用Two-Way ANOVA分析。余检测指标首先进行正态性检验，符合正态分布的数据，多组间比较采用One-Way ANOVA分析，若方差齐采用最小显著差法进行两两比较，若方差不齐则采用Dunnetts T3检验进行两两比较；不符合正态分布的数据，采用非参数检验进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 参芪益智颗粒对5XFAD小鼠筑巢实验的影响

2.2 参芪益智颗粒对5XFAD小鼠避暗实验的影响

Tg+NS组较WT+NS组、WT+SQYZ组小鼠步入暗室错误次数增加、步入潜伏期缩短、明室总时间减少（P<0.05，P<0.01）；Tg+SQYZ组和Tg+HupA组较Tg+NS组小鼠进入暗室错误次数减少、步入潜伏期延长、明室总时间增加（P<0.05）。结果见表2。

2.3 参芪益智颗粒对5XFAD小鼠水迷宫实验的影响

定位航行实验从第4日开始，Tg+NS组小鼠逃避潜伏期较WT+NS组、WT+SQYZ组延长（P<0.05）；Tg+SQYZ组和Tg+HupA组小鼠逃避潜伏期较Tg+NS组缩短（P<0.05）。空间探索实验，Tg+NS组小鼠游泳时间百分比较WT+NS组、WT+SQYZ组减少（P<0.01），Tg+SQYZ组和Tg+HupA组小鼠游泳时间百分比较Tg+NS组小鼠增加（P<0.05）。结果见表3。

2.4 参芪益智颗粒对5XFAD小鼠皮层和海马组织老年斑含量的影响

WT+NS组和WT+SQYZ组小鼠皮层和海马组织均未见SP。Tg+SQYZ组和Tg+HupA组较Tg+NS组小鼠皮层和海马组织SP面积变小、数量减少（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。结果见图1、表4。

皮层

海马

2.5 参芪益智颗粒对5XFAD小鼠皮层和海马组织小胶质细胞和星形胶质细胞激活的影响

Tg+NS组较WT+NS组、WT+SQYZ组小鼠皮层和海马组织Iba1表达明显升高（P<0.001）；Tg+SQYZ组和Tg+HupA组较Tg+NS组小鼠皮层和海马组织Iba1、GFAP表达均明显降低（P<0.05）。结果见表5。

2.6 参芪益智颗粒对5XFAD小鼠皮层和海马组织β淀粉样蛋白1-42含量的影响

Tg+SQYZ组和Tg+HupA组较Tg+NS组小鼠皮层和海马组织Aβ1-42含量均明显减少（P<0.05）。结果见表6。

3 讨论

目前，AD病因及确切发病机制尚未完全阐明，较为公认的学说有Aβ级联假说和β淀粉来源的弥散性配体（Aβ-derived diffusible ligands，ADDLs）假说，但2种假说均认为由单体Aβ1-42聚集成的寡聚体对神经元及突触具有明显损伤作用，指出Aβ1-42在AD的早期病理进程中具有重要影响。Aβ是跨膜淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）在内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器经由β、γ分泌酶的蛋白水解作用代谢而产生的氨基酸多肽片段，因其具1个β片层二级结构而得名。正常情况下，脑内以Aβ1-40为主，而AD发生时其病理产物SP的主要成分则以Aβ1-42为主。Aβ1-42可通过细胞外降解、细胞内吞和转运等机制被清除，而AD患者脑内上述Aβ清除机制明显出现障碍，导致Aβ在脑内过量聚集，形成寡聚体，黏附于神经元，特异性地作用于突触，干扰神经元之间的信号传递而导致明显的学习记忆能力下降。因此，Aβ蛋白是AD发病的中心环节，寡聚化后形成SP，激活小胶质细胞和星形胶质细胞，进而促发炎症反应，诱导神经元及突触丢失，最终导致痴呆的发生。本实验所使用5XFAD转基因小鼠可共表达突变的人β-APP K670N和M671L、Florida突变I716V基因、London突变V717I以及突变早老素蛋白1（Presinilinl，PS1）M146L和L286V突变5个突变位点的基因，可较好地模拟AD患者的临床病理特征，能够在短期内产生大量Aβ1-42及ADDLs，4月龄时已经在大脑皮质、海马等区域形成大量淀粉样斑块，这些改变随年龄的增加逐渐加重，并表现出明显的行为学异常[7]。本课题组前期实验显示，4月龄5XFAD小鼠开始出现空间认知功能障碍[8]，因此我们选取该月龄小鼠进行药物干预实验研究。

20世纪80年代，王永炎教授提出“毒邪”和“络病”可作为中风、痴呆等疾病深入研究的切入点，认为“毒损脑络”是痴呆发生发展的核心病机，并指出益气活血、解毒通络是治疗痴呆的关键。参芪益智颗粒方中黄芪健脾益气、升阳举陷、托毒排脓，人参大补元气、安神益智、补脾益肺、生津，黄芩清热燥湿、泻火解毒、凉血止血，诸药配伍，共奏健脾益气、安神益智、活血化瘀、解毒通络之功效。现代药理研究表明，参芪益智颗粒中有效活性成分黄芪总皂苷、黄芪多糖、人参皂苷、人参多糖、黄芩苷及黄芩素等均对AD动物模型具有认知功能改善作用，其机制与抑制脑内Aβ1-42产生、提高脑内神经递质含量、保护线粒体能量代谢功能及增强脑组织抗氧化能力等密切相关[9-14]。

本研究通过多种行为学实验检测各组小鼠的认知功能，结果表明参芪益智颗粒能够明显改善5XFAD小鼠的社交行为和空间学习记忆能力。为进一步研究参芪益智颗粒改善5XFAD小鼠认知功能的作用机制，分别采用免疫组化和免疫荧光方法对各组小鼠皮层和海马组织SP、Aβ1-42含量、小胶质细胞及星型胶质细胞激活情况进行了定性和定量观察，免疫组化结果显示，模型组小鼠脑组织SP面积及数量较野生型小鼠明显增加，而参芪益智颗粒干预后小鼠脑组织SP面积明显缩小，数量亦明显减少；参芪益智颗粒组小鼠皮层及海马组织可溶性及不可溶Aβ1-42含量均明显降低。研究表明，AD亦是一个局灶性的、非免疫介导的神经系统炎性反应过程，在脑内可见到大量激活的小胶质细胞、反应性星形胶质细胞和炎性细胞因子等。活化的小胶质细胞和星形胶质细胞主要分布于Aβ沉积部位，并导致一系列神经系统的炎症反应。本实验中，免疫荧光检测结果表明，模型组小鼠脑组织中活化的小胶质细胞和星形胶质细胞较野生型小鼠明显增多，而参芪益智颗粒组2种胶质细胞激活明显降低，提示参芪益智颗粒可能通过抑制胶质细胞激活，降低脑组织内的炎症反应。

综上所述，本研究采用5XFAD转基因拟痴呆小鼠模型评价了参芪益智颗粒的脑保护作用，结果表明参芪益智颗粒能够明显改善5XFAD小鼠的学习记忆能力和社交行为，其作用机制与其能够减少5XFAD小鼠皮层和海马组织SP的面积及数量、降低小胶质细胞和星形胶质细胞的过度激活、减少脑内可溶性及不可溶Aβ1-42的含量相关。当然，参芪益智颗粒对5XFAD小鼠脑组织神经递质含量、抗氧化能力、改善脑内线粒体能量代谢等方面的影响仍需进一步深入探讨，以阐明其认知功能改善作用的分子机制，以期为参芪益智颗粒的临床应用提供实验依据。

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