一株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定

郝伟伟，胥燕芳，方鹏飞，廖韦萍

（四川省华派生物制药有限公司，四川简阳　641401）



一株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定

郝伟伟，胥燕芳，方鹏飞，廖韦萍

（四川省华派生物制药有限公司，四川简阳641401）

摘要：本试验采集某养鸡场发病鸡的肾脏和肺组织病料，接种鸡胚盲传，发现从F3代开始出现侏儒胚及发育不良的鸡胚，经病毒血凝性测定、干扰NDV试验、RT-PCR鉴定，判定该病毒为鸡传染性支气管炎病毒，命名为HP-W株。对该分离株的S1基因进行扩增、测序，结果表明该毒株的S1基因长度为1620bp，与变异株4/91的核苷酸同源性为98.9%，氨基酸同源性为98.1%，与其他毒株核苷酸及氨基酸序列的同源性均低于80%。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒；分离；鉴定

鸡传染性支气管炎（IB）简称鸡传支，是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病[1]，是家禽二类传染病，也是危害世界养禽业最为严重的疫病之一。该病毒主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统以及泌尿生殖系统，造成鸡咳嗽、喷嚏、气管啰音、呼吸困难、肠炎、产蛋数量和质量下降等症状[2-3]。鸡传染性支管炎的临床分型主要包括呼吸型、生殖型（又称产蛋鸡变异型）、肾型、腺胃型等，并不断产生新的基因型[4]。IBV经常同大肠杆菌、NDV 及AIV混合感染鸡群，混合感染后的病情比单一感染更加严重，常导致极高的发病率和死亡率，经济损失严重[5-6]。本试验从一混合感染禽流感H9亚型病毒的病料中分离得到一株传染性支气管炎病毒，现报告如下。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1病料四川眉山市某大型养鸡场21日龄商品肉鸡群发生疫情。病鸡主要表现为食欲下降，精神萎顿，张嘴呼吸、气管有啰音；病情持续一周，鸡群发病率约50%，死亡率约10%；剖检后，大多数病死鸡的支气管内有黄色干酪样栓塞。无菌采集发病鸡的肾脏及肺组织作为病料保存。

1.1.2试验动物SPF蛋和SPF鸡购自济南禽业科技有限公司，SPF蛋购买后由实验室孵化，SPF鸡饲养在隔离器中。

1.1.3 H9亚型禽流感阳性血清由哈尔滨兽医研究所生产。

1.1.4新城疫LaSota株病毒购自中国兽医药品监察所，实验室保存。

1.1.5生化试剂Trizo1 Reagent为Invitrogen公司产品；RNA PCR Kit、Mix、D2000 DNA Marker、胶回收试剂盒均为TaKaRa公司产品；琼脂糖购自GIBCO公司。

1.2试验方法

1.2.1病料处理无菌取病料，剪碎，按1g∶5 mL加入灭菌PBS液（pH值7.2），在研钵中充分研磨，研磨后的病料冻融3次，以3 000r/min离心10min，取上清液经0.22μm滤器过滤。

1.2.2疾病诊断

1.2.2.1病毒繁殖及传代。将处理好的病料上清液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.1mL/胚，同样的方法用PBS液接种鸡胚作为阴性对照。接种后将鸡胚置37℃温箱中继续孵育。每24h观察鸡胚1次，弃掉24h内死亡胚，收集120h内的死胚和部分活胚（4℃致死），收获尿囊液（记为E1代）进行传代。剩余活胚培养至144h，观察鸡胚病变。

1.2.2.2 HA试验。按常规微量法对传代尿囊液进行HA测定。

1.2.2.3 RT-PCR检测。对有血凝性的尿囊液采用Trizo1法提取RNA，分别以H9亚型AIV、NDV、IBV特异性引物进行RT-PCR扩增，并对产物进行电泳，观察结果。

1.2.3鸡传染性支气管炎病毒分离取一定体积处理过的病料于管制瓶中，加入等体积H9亚型禽流感阳性血清，37℃中和1h。将中和的病毒液接种10日龄鸡胚尿囊腔，0.2mL/胚，同样的方法用PBS液接种鸡胚作为阴性对照。接种后将鸡胚置37℃温箱中继续孵育。每24h观察鸡胚1次，弃掉24h内死亡胚，收集36～48h内的死胚和部分活胚（4℃致死），收获HA阴性尿囊液（记为F1代）进行传代。剩余活胚培养至144h，观察鸡胚病变。

1.2.4鸡传染性支气管炎病毒鉴定

1.2.4.1病毒血凝性测定。试验共分为4组，A组：取F6代鸡胚尿囊液，加1%胰酶；B组：取F6代鸡胚尿囊液，不加胰酶；C组：取PBS液接种10日龄鸡胚，48h收获尿囊液加1%胰酶；D组：取PBS液接种10日龄鸡胚，48h收获尿囊液不加胰酶。四个试验组均置于37℃下处理4h，然后按常规微量法测定红细胞凝集价。

1.2.4.2干扰NDV试验。将10日龄健康鸡胚分为4组（分组情况见表1），接种后于37℃孵育72h，无菌收集尿囊液，按常规方法分别测定各组血凝（HA）滴度。

表1　干扰NDV试验的鸡胚分组

1.2.4.3 S1基因序列测定参照GenBank已经公布的IBV全基因组序列，在进行多序列比对分析的基础上，利用IBV基因组S1基因两端外的保守序列，应用Premier 5.0软件设计一对引物，用于扩增包含IBV S1基因序列的一段约1 720 bp的序列。采用Trizo1法提取病毒RNA，用RT-PCR方法扩增S1基因，再进行电泳，切下目的片段后进行胶回收。将回收到的DNA片段送去英潍捷基生物公司进行基因测序，然后把测序结果同GenBank上的S1基因cDNA序列进行比对。

2　结果

2.1疾病诊断

2.1.1鸡胚病变病料处理传代后，第1代出现4枚死胚，其余活胚未观察到明显病变，从第3代开始出现侏儒胚及发育不良鸡胚，符合鸡传染性支气管炎典型病变，因此判定病料中含有鸡传染性支气管炎病毒。

2.1.2 HA试验结果E1代死胚及个别活胚尿囊液能够凝集1%的新鲜鸡红细胞，E2代尿囊液均能凝集1%的新鲜鸡红细胞，凝集价为1∶28～1∶210。怀疑病料中含有新城疫或禽流感病毒。

2.1.3 RT-PCR检测结果分别以NDV、H9亚型禽流感AIV、IBV特异性引物用RT-PCR法检测尿囊液，电泳结果见图1。图中可见H9亚型AIV及IBV引物均扩增出特异性条带，判定病料中含有H9亚型AIV及IBV。

2.2鸡传染性支气管炎病毒分离F1代未见明显病变，从F3代开始出现侏儒胚。传至F6代，鸡胚出现稳定病变，表现为：胚体发育明显受阻，明显小于正常鸡胚，出现卷曲胚、矮小胚、羽毛发育不良；死亡鸡胚有充血、出血的现象，死亡时间大多在72～120h，死胚尿囊液明显增多，羊膜增厚，表面混浊，胚体发生蜷缩，趾爪紧抱头部（见图2）。尿囊液HA检测均为阴性。将分离到的病毒命名为HP-W株。

图1　病料RT-PCR检测结果

图2　鸡胚病变

2.3鸡传染性支气管炎病毒鉴定

2.3.1病毒血凝性测定结果病毒血凝测定结果见表2。结果显示：F6代尿囊液血凝价为0，经1%胰蛋白酶处理后血凝价为71og2，PBS接种的鸡胚尿囊液经胰酶处理及未经处理的血凝价均为0。试验表明，该病毒本身不能凝集红细胞，但是经过1%胰蛋白酶处理后，能够使红细胞发生凝集。

2.3.2干扰NDV试验结果干扰NDV试验结果见表3。接种分离病毒液及PBS的尿囊液HA均为阴性；同时接种分离病毒液及NDV LaSota病毒的鸡胚尿囊液HA效价为21og2～41og2；单独接种NDV LaSota病毒的鸡胚尿囊液HA效价为91og2～101og2。说明分离到的病毒对NDV LaSota病毒有明显的干扰作用。

表2　病毒血凝性测定结果

表3　干扰NDV试验结果

2.3.3 RT-PCR鉴定电泳结果见图3。从图中可以看出，F6代尿囊液通过RT-PCR扩增后的产物大小约1700bp，与预期片段大小相符。使用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收目的片段，并送样测序。测序结果表明，分离的IBV毒株的S1基因长度为1620bp，编码540个氨基酸。

图3　RT-PCR电泳结果

选取具有代表性的国内外毒株及疫苗株利用DNAMAN软件进行核苷酸序列比对，发现HP-W株S1基因的核苷酸序列与国内使用较广泛的欧洲呼吸型疫苗株H120、H52的同源性分别为78.7%和78.8%；与美国肾型、呼吸型代表毒株Ho1te、M41的同源性分别为78.8%和79%；与澳大利亚肾型株T的同源性为79.4%；与台湾地区分离株JP8443、TW97-4的同源性分别为78.4%和77.4%；与国内肾型疫苗株W93和Ji1in的同源性为78.6%和79.1%；与腺胃型毒株CK/CH/LDL/97I的同源性为78.7%；与变异株4/91的同源性为98.9%。HP-W株S1基因编码的氨基酸序列同变异株4/91的同源性达98.1%，同其他毒株氨基酸序列的同源性均低于80%。利用软件构建系统进化树，结果显示该分离株（HP-W株）与现有的呼吸型及肾型疫苗株的亲缘关系均较远，同变异株4/91有很近的亲缘关系。

3　讨论

我国自从1982年首次分离到IBV后，不断有IBV变异毒株发生和流行的报道[7]。调查研究发现，2010～2012年间，IBV在常见疫病中的检出率超过15%，混合感染率也呈现不断增加的趋势，说明中国鸡传支流行越来越严重[8]。导致这种结果的主要原因是IBV的变异产生了大量免疫逃逸毒株，或者因为持续使用各种各样的疫苗，出现了大量二重、三重或多重的杂交、变异毒株。IBV变异毒株的抗原性发生改变，导致其血清型众多，且新的血清型还在不断出现，但彼此之间的交叉保护率较低或不产生交叉保护，这使得IB的防治越来越困难。本次从发病鸡肾脏和肺组织中分离得到一株病毒“HP-W”，经血凝特性测定、干扰NDV试验及RT-PCR，鉴定得出所分离到的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。

鉴于IBV的多型性和可变性，且在疾病的传播过程中有变异株或新的基因型出现，需要对IBV的分子流行病学进行调查分析，掌握其分子流行病学规律，了解各个地区流行毒株的基因型，有针对性地选择疫苗进行防控。本研究为疫苗株的筛选提供了试验依据，为鸡传染性支气管炎疾病的防控奠定了基础。

参考文献：

[1]Saif Y M.禽病学[M].11版.北京：中国农业出版社，2005：108-130.

[2]朱英奇，李露，王世传，等.鸡传染性支气管炎病毒上海株的分离与鉴定[J].中国动物传染病学报，2012，20 （4）：24-27.

[3]邵攀峰，李新华，李少丽，等.鸡传染性支气管炎病毒HZ13株的分离与鉴定[J].中国家禽，2014，36（4）：43-45.

[4]李晓峰，郑振宇，杨红瑞，等.一株鸡呼吸型传染性支气管炎病毒的分离鉴定[J].河南科技学院学报，2012，40 （6）：39-43.

[5]陈雨昕.H9N2亚型禽流感病毒与鸡传染性支气管炎病毒的协同致病作用[D].扬州：扬州大学，2014.

[6]葛红江，李时健.鸡传染性支气管炎与大肠杆菌混合感染的诊治[J].畜禽医药，2014（12）：41-42.

[7]李盂，孙蓉，梁远东，等.鸡传染性支气管炎病毒抗原性的研究进展[J].广西畜牧兽医，2010，26（5）：317-322.

[8]尤永君，张国中，刘月焕，等.2010～2012年中国部分地区鸡传染性支气管炎流行病学调查[J].畜牧兽医学报，2015，46（2）：264-172.

Isolation and Identification of a Strain of Avian Infectious Bronchitis Virus

HAO Weiwei，XU Yanfang，FANG Pengfei，et a1.
（Sichuan Huapai Biopharmaceutica1 Co.Ltd.，Sichuan Jianyang 641401，China）

Abstract：Nephridia1 and 1ung tissue of sick chicken co11ected from pou1try yard，were inocu1ated on SPF embryonated chicken eggs for seria1 passages.Dwarf and dysp1asia embryos were observed from 3rd passage.The resu1ts of vira1 hemagg1utination test，interference of NDV test and RT-PCR identification demonstrated that the virus was identified as IBV，named HP-W.S1 gene of this strain was amp1ified and sequenced，we found its 1ength was 1620bp，and the sequence of nuc1eotides and aminoacids shared 98.9% and 98.1% identity with 4/91 strain，but 1ess than 80% with other strains.

Key words：Avian infectious bronchitis virus；Iso1ation；Identification

作者简介：郝伟伟（1985—），女，山东济宁人，硕士，四川省华派生物制药有限公司研发人员，从事禽苗研发工作。

收稿日期：2015-10-30

中图分类号：S858.315.3

文献标识码：B

文章编号：1001-8964（2016）02-0029-04