苦瓜总皂苷对2型糖尿病肾病大鼠肾脏细胞间纤连蛋白和胶原Ⅳ蛋白表达的影响

陈　伟,田　鲁,王 　港,李　易，2*

(1.黄石市中心医院肾内科，湖北 黄石 435000；2.湖北理工学院医学院，湖北 黄石 435000)



苦瓜总皂苷对2型糖尿病肾病大鼠肾脏细胞间纤连蛋白和胶原Ⅳ蛋白表达的影响

陈伟1,田鲁1,王 港1,李易1，2*

(1.黄石市中心医院肾内科，湖北 黄石 435000；2.湖北理工学院医学院，湖北 黄石 435000)

摘要：目的探讨苦瓜总皂苷对2型糖尿病肾病大鼠细胞间纤连蛋白(FN)和胶原Ⅳ蛋白(Ⅳ-CP)表达的影响。方法雄性SD大鼠48只随机分为正常对照组、2型糖尿病肾病模型组及苦瓜总皂苷5 mg/(kg·d)，治疗组左肾切除加1次大剂量链脲佐菌素腹腔注射建立动物模型，正常对照组和模型组给予生理盐水灌胃，苦瓜总皂苷治疗组给予苦瓜总皂苷灌胃，分别于实验第4、8周处死大鼠各半，测血糖、24 h尿蛋白定量以及炎性因子；免疫组化、RT-PCR以及Western Blot检测FN和Ⅳ-CP蛋白的表达。结果治疗组尿蛋白和血清肌酐与模型组相比明显减少，血糖明显升高(P<0.05)；免疫组化、RT-PCR和Western Blot与模型组相比治疗组大鼠肾脏组织FN和Ⅳ-CP表达明显降低(P<0.05)。结论苦瓜总皂苷可以通过抑制糖尿病肾病大鼠肾组织细胞间纤连蛋白和Ⅳ型胶原的表达，改善肾功能。

关键词：苦瓜总皂苷;2型糖尿病肾病大鼠;纤连蛋白;Ⅳ型胶原

近年来随着人民生活水平的提高，特别是饮食结构的改变，2型糖尿病的发病率逐年增高[1]，研究[2]显示，控制不佳的2型糖尿病患者约三分之一可发展为糖尿病肾病。有文献报道[3]苦瓜总皂苷对2型糖尿病有一定的治疗作用，但鲜见对糖尿病肾病的研究报道，本研究通过建立2型糖尿病肾病大鼠模型并给予其苦瓜总皂苷干预，以期明确在治疗2型糖尿病肾病方面的作用机制，为本药的开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1动物选取清洁级雄性SD大鼠48只，体质量180～200 g，购自华中科技大学动物实验中心，大鼠合格证号为SCXK(鄂)2010-0009，适应性喂养2周后行相应实验。

1.2动物分组及造模方法大鼠随机分成正常对照组、2型糖尿病肾病模型组以及苦瓜总皂苷干预治疗组3组，其中糖尿病肾病组和模型组施行单侧肾切除手术:1)用1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)将大鼠麻醉，麻醉后将其固定于固定板上；2)切开大鼠腹部找到左肾；3)将大鼠左肾蒂部位结扎并摘除，之后给予青霉素腹腔注射后缝合；4)正常组大鼠采用同样方法处理大鼠，但肾脏不摘除。5)术后每天给予大鼠肌注1次青霉素，时间为1周。后予大鼠再饲养3周，3周后，糖尿病肾病组以及模型对照组大鼠给予链脲佐菌素50 mg/kg行1次性腹腔注射，注射3 d后尾静脉取血，取血后血糖仪测定血糖，测定空腹血糖大于16.7 mmol/L的大鼠判定为造模成功。

模型建立成功后，正常对照组和模型组给予生理盐水灌胃，苦瓜总皂苷治疗组给予苦瓜总皂苷灌胃，模型成功后于实验2、4、6、8周末分别测大鼠血糖水平；分别于实验第4、8周处死大鼠各半，测24 h尿蛋白定量；取肾组织做HE染色行肾组织病理观察、RT-PCR以及Western Blot检测肾组织FN和IV-CP蛋白和mRNA表达。

1.3标本收集

1.3.1尿液标本收集分别于治疗4、8周后，每组随机取8只大鼠置于代谢笼收集24 h尿液并计算总尿量。24 h尿蛋白量采用公式为：24 h尿蛋白量(mg)=尿蛋白浓度(g/L)×24 h尿量(mL)。

1. 3.2血液标本收集第2、6周采用断尾法收集大鼠血液，第4、8周与禁食12 h后，用10%水合氯醛(2.0 mL/kg)给予大鼠腹腔注射麻醉。麻醉完成后沿大鼠腹中线切开皮肤和肌肉，将心脏暴露，之后用10 mL注射器插入心尖取血，取血后摘除右肾备用检测。全自动生化分析仪测定血清白蛋白及血清肌酐值。

1.4免疫组化肝脏组织切片后室温中平衡10 min之后用预冷丙酮固定后晾干，晾干后采用PBS缓冲液冲洗3次，冲洗完成后用0.3%的H2O2室温浸泡10 min，再用PBS缓冲液冲洗3次；滴加一抗，16 h后，采用PBS缓冲液冲洗3次后滴加二抗，室温孵育1 h。PBS再冲洗3次，DAB显色，苏木素复染，水洗后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察结果。

1.5RT-PCR检测大鼠肾组织中FN和IV-CP mRNA表达肾脏组织用天根总RNA试剂盒提取后，定量，并行逆转录扩增反应，扩增条件如下：94 ℃预变性2 min，1个循环；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃总延伸6 min。引物序列见表1。

表1　纤连蛋白和Ⅳ型胶原引物

1.6Western Blot检测大鼠肾组织中纤连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达称取100 mg肾脏组织，电子匀浆机磨碎，低温高速匀浆机离心，4 000 r/min，离心后取上清液分装于1 mL的离心管中并置于超低温冰箱中保存，电泳时每组各取样本60 μg进行蛋白电泳，电泳方法按照文献[4]进行，收集到电泳图片后用Image J计算各条带的灰度值，Image J计算灰度值。

2结果

2.1实验大鼠一般情况从造模成功后开始记录大鼠一般情况，正常组大鼠饮食、饮水、精神状态以及平常活动均正常，同时毛发光滑；模型组大鼠均呈现出明显的多尿、多饮、多食等症状，其精神明显不佳，此外毛发可见其明显杂乱，同时表现有淡黄色(可能沾有尿液)，治疗组大鼠在治疗4周后相较于正常组饮食也呈增加的趋势，但没有模型组增加量大，治疗8周后与治疗4周后基本一致。

2.2大鼠血糖、24 h尿蛋白定量及血肌酐和血浆白蛋白变化见表2、表3。

表2　对大鼠血糖变化的影响　mmol/L

注：与模型组相比，#P<0.05

表3　对大鼠24 h蛋白尿量、血肌酐和血浆白蛋白变化的影响±s，n=18)

注：与模型组相比，#P<0.05

2.3大鼠肾脏组织中FN和IV-CP mRNA表达见表4。

2.4大鼠肾脏组织中FN和IV-CP 蛋白表达见表5。

组 别FN治疗4周治疗8周IV-CPmRNA治疗4周治疗8周正常组1.24±0.241.23±0.25 0.83±0.17 0.92±0.24 模型组2.35±0.461.64±0.26 1.41±0.15 1.69±0.19 治疗组1.29±0.261.31±0.23#1.06±0.16#1.02±0.17#

注：与模型组相比，#P<0.05

组 别FN治疗4周治疗8周IV-CP治疗4周治疗8周正常组0.87±0.19 0.89±0.17 1.27±0.26 1.15±0.18 模型组1.86±0.28 1.72±0.27 3.22±0.27 3.42±0.26 治疗组1.59±0.31#1.54±0.16#1.93±0.26#1.82±0.32#

注：与模型组相比，#P<0.05

2.5FN和IV-CP免疫组化免疫组化可见，空白组大鼠肾脏组织中FN和IV-CP呈低表达状态，模型组FN和IV-CP表达明显升高，苦瓜总皂苷治疗4周后有一定降低，治疗8周后进一步降低。

3讨论

关于2型糖尿病肾病发病机制的研究目前有许多的学说[5-10],研究较多的有基因氧化应激学说、遗传学说、炎症学说、代谢障碍学说、血流动力学改变学说等，但具体为哪种发病机制造成本病的发生以及后续进展目前还没有明确的定论，但不管是哪种机制，哪种信号通路影响，其对肾脏的改变是毫无疑问的。肾脏组织学改变除了研究中较多见到肾小球肥大、肾小球炎症等外，在肾脏细胞间的细胞外基质聚集、基底膜增厚等也是最典型的特点。目前国外许多专家均将细胞外基质的积聚作为治疗糖尿病肾病进展的一个热点，关于肾脏中细胞外基质的常见蛋白有纤维连接蛋白、Ⅴ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白以及一些蛋白多糖等。当肾脏受到长期的高血糖、高炎性因子浸润后，可造成肾脏细胞发生炎症反应，从而肿胀，这种细胞的肿胀又可造成病理和细胞外基质转录蛋白的激活，进而分泌过量的细胞外基质蛋白，最终造成肾脏的损害和进展[11-15]。

苦瓜其本身属于葫芦科苦瓜属植物苦瓜MomordicacharantiaL的未成熟果实的一种，也是我国常见的菜系，但关于其药用机理人们了解甚少，苦瓜有着悠久的入药史，其中《本草纲目》描述，苦瓜苦寒无毒，其可解劳乏，除邪热，清心明目。现代许多学者对苦瓜进行了大量的研究，研究均提示苦瓜具有明显的抗氧化、提高免疫力、降血糖、降低胆固醇、甚至可以抗艾滋病病毒的作用[16-17]。本次作者用苦瓜总皂苷治疗2型糖尿病肾病大鼠，研究显示：苦瓜总皂苷不仅有降低血糖的作用，同时也可明显改善2型糖尿病大鼠24 h尿量、尿蛋白以及血清肌酐；同时也可抑制大鼠肾脏细胞间FN和IV-CP蛋白和mRNA的表达，具有很好的药用价值。

参考文献：

[1]韩卓笑,牛尚梅,王芸,等.肥胖与2型糖尿病肾病的研究进展[J].医学综述,2015,21(3):488-490.

[2]BONDEVA T,HEINZING J,RUHE C,et al.Advanced glycated end-products affect HIF-transcriptional activity in renal cells[J].Mol Endocrinol,2013,27(11):1918-1933.

[3]柴瑞华,肖春莹,关健,等.苦瓜总皂苷降血糖作用的研究[J].中草药,2008,39(5):746-751.

[4]武俊紫,贾亚敏,沈平瑞,等.富硒灵芝调控大鼠乙酰辅酶A羧化酶α表达治疗非酒精性脂肪肝病的研究[J].天然产物研究与开发,2014,26(6):1086-1092.

[5]THALLAS-BONKE V,JHA J C,GRAY S P,et al.Nox-4 deletion reduces oxidative stress and injury by PKC-α-associated mechanisms in diabetic nephropathy[J].Physiol Rep,2014,2(11):12192.

[6]王爱民,雷闽湘,刘泽灏,等.2型糖尿病肾病危险因素分析[J].中国现代医学杂志,2005,15(1):116-119.

[7]SEO J W,KIM Y G,LEE S H,et al.Mycophenolate Mofetil Ameliorates Diabetic Nephropathy in db Mice[J].Biomed Res Int,2015(30):1627.

[8]曹蓓,王旭.糖尿病肾病的中医药治疗进展[J].吉林中医药,2015,35(4):430-432.

[9]EBOH C,CHOWDHURY T A.Management of diabetic renal disease[J].Ann Transl Med,2015,3(11):154.

[10]韩雪华.糖尿病肾病中医药治疗近况[J].长春中医药大学学报,2013,29(4):742-743.

[11]WONG M,SAAD S,ZHANG J,et al.Semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) inhibition ameliorates kidney fibrosis in a unilateral ureteral obstruction murine model[J].Am J Physiol Renal Physiol,2014,307 (8):F908-F916.

[12]XU W,SHAO X,TIAN L,et al.Astragaloside IV ameliorates renal fibrosis via the inhibition of mitogen-activated protein kinases and antiapoptosis in vivo and in vitro[J].J Pharmacol Exp Ther,2014,350 (3):552-562.

[13]AHAD A,AHSAN H,MUJEEB M,et al.Gallic acid ameliorates renal functions by inhibiting the activation of p38 MAPK in experimentally induced type 2 diabetic rats and cultured rat proximal tubular epithelial cells[J].Chem Biol Interact,2015,240(1):292-303.

[14]YONEKURA Y,FUJII H,NAKAI K,et al.Anti-oxidative Effect of the β-blocker Carvedilol on Diabetic Nephropathy in Non-obese Type 2 Diabetic Rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2015,42(9):12447.

[15]ELLEIN MREICH,XING-MING CHEN,AMGAD ZAKY,et al.The role of Krüppel-like factor 4 in transforming growth factor-β-induced inflammatory and fibrotic responses in human proximal tubule cells[J].2015,42(6):680-686.

[16]董英,张慧慧.苦瓜多糖降血糖活性成分的研究[J].营养学报,2008,30(1):54-56.

[17]马春宇,于洪宇,王慧娇,等.苦瓜总皂苷对2型糖尿病大鼠降血糖作用机制的研究[J].天津医药,2014,42(4):321-324.

Total saponins of bitter gourd to fibronectin and collagen Ⅳ in type 2 diabetic nephropathy rat

CHEN Wei1,TIAN Lu1,WANG Gang1,LI Yi1,2*

(1.Department of Kidney,Huangshi Central Hospital,Huangshi 435000,Hubei Province,China;2.Medical College,Hubei Polytechnic University,Huangshi 435000,Hubei Province,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of total saponins from bitter to the expression of fibronectin and collagen Ⅳin 2 diabetic nephropathy rats.MethodsMale SD rats were randomly divided into normal control group,diabetic nephropathy model group and saponins treatment group (5 mg/kg·d treatment) and left renal resection plus a large dose of streptozocin (STZ) intraperitoneal injection of established animal model,after successful built model,normal control group and model group were given physiological saline by gavage,treatment group give saponins gavage,respectively in the 4 weeks,8 weeks half of rats were sacrificed,measuring glucose,24 h urine protein quantitative and inflammatory factors;immunohistochemistry,RT-PCR and Western blot detection of renal fibrosis even protein and collagen Ⅳ expression.ResultsThe serum creatinine and serum creatinine in the treatment group were significantly decreased compared with the model group,the difference was significant (P<0.05);After treatment,Immunohistochemistry,RT-PCR and Blot Western showed that:compared with the model group,the expression of fibronectin and type Ⅳ collagen protein in the kidney tissue was significantly lower than that in the treatment group (P<0.05).ConclusionTotal saponins from bitter gourd can inhibit the expression of fibronectin and type Ⅳ collagen in renal tissue of diabetic nephropathy rats,and improve renal function.

Keywords：total saponins of bitter gourd;type 2 diabetic nephropathy rats;fibronectin;Ⅳ collagen protein

(收稿日期:2015-10-09)

文章编号：2095-6258(2016)02-0237-04

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

*通信作者：李易，女，硕士，副主任医师，电话-13597617350，电子信箱-hsyiyuantougao@163.com

作者简介：陈伟(1980-)，男，硕士研究生，主治医师，主要从事肾病的内科治疗及肾脏透析。

基金项目：湖北省科技厅面上项目“苦瓜总皂苷对2型糖尿病肾病大鼠的治疗作用”(2013FFA003)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.006