添加生物炭对烤烟碳氮代谢的影响

张嘉炜,杨永霞,冯小虎,贾宏昉,张松涛,张洪映,崔 红*

(1.河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002；2.江西省烟草公司 抚州市公司,江西 抚州 344000)

添加生物炭对烤烟碳氮代谢的影响

张嘉炜1,杨永霞1,冯小虎2,贾宏昉1,张松涛1,张洪映1,崔 红1*

(1.河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002；2.江西省烟草公司 抚州市公司,江西 抚州 344000)

为探究添加生物炭对烤烟碳氮代谢的影响，以烟草品种K326为材料，从细胞组织结构、基因表达以及物质代谢3个层面进行了系统研究。超微结构分析表明：中部叶成熟早期，不施生物炭处理的烟叶淀粉粒积累较多，随着叶片成熟降解更快。基因表达分析显示：打顶后，糖、淀粉代谢相关基因表达逐渐增强，氮代谢相关基因的表达减弱。中部叶成熟后期，添加生物炭越多，相关基因表达越强。物质代谢分析表明：打顶后，添加生物炭处理的总糖、还原糖含量降低，调制后，糖含量较高。打顶及调制后，添加600 kg/hm2生物炭处理的淀粉含量较高。添加生物炭后，总氮、烟碱含量增加，调制后差异变小，这说明添加生物炭对烟叶碳氮代谢有较大影响，进而影响烟叶品质。

烤烟；碳氮代谢；生物炭；基因表达

在烟株生长发育过程中,碳氮代谢是最基本的代谢过程,尤其是在成熟过程中,烟叶各种化学成分的组成、比例及含量受碳氮代谢的强度、动态变化模式和协调程度的影响很大[1]。淀粉、总糖和还原糖含量既是碳代谢的关键指标，又是重要的致香物前体物。氮素调控烟叶内的能量代谢和物质转化，同时也是烤烟生产的重要营养元素之一，对烟叶品质具有很大的影响[2-4]。因此，优质烟叶的生产必须调控碳氮代谢的平衡，控制碳氮代谢相关物质在适宜的范围内。烟草碳氮代谢受多种因素影响，如品种、发育时期、栽培措施、肥料、生态环境、成熟度等都会影响碳氮代谢的强度[5-14]。

生物炭(Biochar)是以自然界广泛存在的木材、家禽粪便和秸秆等生物质资源为基础，在相对较低的温度(<700 ℃)和无氧或限氧的条件下炭化热解而得到的一种细粒、多孔的碳质材料[15]，具有良好的综合生物效应[16]。研究表明，添加生物炭能够提高根系生理活性、改良根系形态、增强土壤肥力、维持较为适宜的根冠比，从而提高作物产量[17-21]。此外，添加生物炭还能影响土壤微生物群落的组成、氮循环尤其是销态氮的代谢、减轻重金属积累[22-25]。目前，生物炭在烟草上的研究主要集中在对植烟土壤的理化性质及经济性状的影响上[26-27]。本试验通过对植烟土壤添加不同量的生物炭，从细胞组织结构、分子机理以及物质代谢3个层面，系统地研究了生物炭对烟株生长发育及调制后碳氮代谢的影响，为优质烟叶生产提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和设计

2013年在江西省抚州市广昌县长桥镇种植烟草品种K326。按照当地优质烟栽培技术规范实施管理。行距1.3 m，株距50～55 cm，试验地为水田砂壤土，土壤有机质为25.8 g/kg、碱解氮210 mg/kg、速效磷10 mg/kg、速效钾76 mg/kg、pH值5.2。在初花期进行打顶，足量留叶。并对中部叶(第12叶位)进行挂牌标记。试验添加的生物炭原材料为花生壳，加工时，首先将风干的花生壳粉碎，然后装入炭化炉中，在500 ℃密封低氧状态下连续炭化，而后过筛，制成直径为3～5 mm的颗粒状生物炭。

试验田分为4个处理:常规施肥(CK)；T1：在常规施肥的基础上，增施生物炭肥300 kg/hm2；T2：在常规施肥的基础上，增施生物炭肥600 kg/hm2；T3：在常规施肥的基础上，增施生物炭肥900 kg/hm2。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草叶片超微结构观察 分别在打顶后10、20、30、40 d，按照文献[5]的方法取样。取中部叶第6～8条侧脉间1 mm×3 mm的叶肉组织切片，于5%戊二醛溶液中4 ℃条件下固定保存。经固定、脱水、包埋、切片及双重染色后，于Hitachi 600透射电镜下观察并拍照。

1.2.2 碳氮代谢关键基因表达分析 分别在打顶后10、20、30、40 d，取中部叶片，每个样品取自3株不同烟株的中部叶去除主脉后混合，迅速用锡箔纸包裹放入液氮冷冻，带回实验室于-80 ℃冰箱中保存。烟叶总RNA的提取采用Trizol法，反转录采用随机引物法。查询Genbank发布的烟草碳氮代谢关键基因序列，采用Primer Premier 5软件设计引物，以L25为参考序列，具体引物序列见表1，采用半定量RT-PCR进行基因表达差异研究。PCR反应体系为20 μL，PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃(退火温度根据基因不同而变化)复性30 s；72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。采用1.0%琼脂糖凝胶进行PCR产物的检测。

表1 引物序列

1.2.3 化学成分分析 在烟草生长发育过程中的取样时期同上，每个样品取自3株不同烟株的中部叶，并混合，液氮保存，备用。烤后样品由专职评级人员按照国标进行烟叶分级，采用定等级取样法采集C3F(中橘三)。每个样品取3 kg用于化学成分测定，烟样烘干、粉碎后过60目筛备用。

采用德国Seal-AA3流动分析仪(德国BRAN & LU-EBBE公司生产)测定烟叶常规化学成分，样品的前处理过程如下：于50 mL磨口三角瓶中，精确称取0.25 g试样，加入25 mL 5%醋酸溶液后在振荡器上震荡萃取30 min。用定性滤纸过滤后采用Seal-AA3连续流动分析仪按YC/T 159─2002、YC/T 216─2002标准分别测定烟叶烟碱、总糖、还原糖和淀粉含量。总氮的测定采用YC/T 161─2002标准进行。测定前，于0.1 g样品中加入1 g K2SO4、0.1 g HgO和5 mL浓硫酸，消化3 h，用定性滤纸过滤后定容到100 mL即可进行总氮的测定。

2 结果与分析

2.1 叶绿体超微结构

图1超微结构显示，添加不同量生物炭处理的细胞组织结构变化规律趋于一致，中部叶成熟前期，烟叶淀粉粒积累相对较少、体积变化较小，且未添加生物炭处理的淀粉粒体积相对较小。随着叶片成熟，淀粉颗粒逐渐积累，至打顶后40 d，不添加生物炭处理的淀粉积累较多。成熟后期，类囊体片层消失，嗜锇颗粒增加，细胞表现出衰老降解的特点。不施生物炭处理(CK)的降解更充分、发育更快。

CK、T1、T2、T3的1～4分别表示CK、T1、T2、T3打顶后10、20、30、40 d(х10000)，ST:淀粉粒，DO：嗜锇颗粒，Ch:叶绿体

2.2 碳氮代谢途径关键基因表达规律

由图2可知，打顶后10和40 d，与糖代谢过程中库结构的膨大生长密切相关的液泡转化酶(Vacuolar invertase,Vi)、与糖积累有关的磷酸合成酶(Sucrosephosphatesynthase,SPS)、蔗糖磷酸化酶(Sucrose-6-phosphate phosphatase,SPP，催化蔗糖和磷酸分解)和蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SuS，降解蔗糖，提供合成淀粉等多糖的葡萄糖供体)，以及与淀粉代谢有关的基因ADPG焦磷酸化酶(ADP Glucose Pyrophosphorylase，AGPase)和颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase，GBSSI，控制直链淀粉的合成)均表现为CK和T3处理表达较强。打顶后20 d，T1处理的基因表达较强；打顶后30 d，T2处理的烟叶基因表达最强，这说明中部叶成熟后期，添加生物炭越多，糖、淀粉代谢相关基因表达越强。随着叶片成熟氮代谢相关基因表达呈现逐渐减弱的趋势。打顶后，与氮代谢有关的硝酸还原酶(Nitrate reductase,Nitr，主要作用是把NO3-离子还原成NO2-离子，是氮代谢的第一个关键酶和限速酶)总体表现为T2处理的基因表达较强，亚硝酸还原酶(Nitrite reductase,NIR，主要作用是把NO2-离子还原成NH4+离子)和催化产生谷氨酰胺合成的氨酰胺合成酶(Glutamine synthase，GS，N素转移酶)则表现为T2和T3处理的表达较强。

图2 不同处理的碳氮代谢相关基因表达差异比较

2.3 不同生物炭处理常规化学成分分析

由图3可知，打顶后随着烟株的生长，各处理的总糖和还原糖含量变化趋势基本相同，均呈现出在打顶后含量下降，而在打顶后30 d开始上升。CK的总糖、还原糖含量高于施用生物炭的处理。T1与T3的含量变化趋势相似，两者的总糖含量在打顶后20 d略微下降，之后上升，打顶后40 d上升明显。T2在打顶后30 d的含量最低，之后明显上升。调制后，添加生物炭越多，总糖、还原糖含量也越高。

图3 不同处理的糖含量变化趋势

由图4可知，打顶后，随着烟株的生长，除T2外，其余各处理的淀粉含量变化趋势基本相同，均呈现出淀粉含量逐渐增加的趋势，打顶后40 d烟叶采收期达到最高。其中，CK的含量最高。而T2处理在打顶后40 d的淀粉含量有所降低。调制后，以T2处理的淀粉含量最高。

图4 不同处理的淀粉含量变化趋势

如图5所示，打顶后，除T3外，其余各处理的烟碱含量大体呈上升趋势。且CK的烟碱含量均低于其他处理。调制后，各处理的烟碱含量相差较小，而T3的烟碱含量略低于其余各处理。打顶后，总氮含量总体呈现逐渐降低的趋势。在烟叶生长发育期间，总氮含量较低。调制后，各处理的差异不大。

图5 不同处理的烟碱和总氮含量变化趋势

3 小结与讨论

碳氮代谢是烟草生长发育的基本过程，烟叶品质在很大程度上受烟株碳氮代谢的平衡和协调程度的影响。生物炭作为一种新型的材料，因其综合生物效应良好，目前在生产上应用较广。添加生物炭可以改善土壤理化性质、持留土壤养分、促进植物生长[16]。通过对细胞组织结构的分析表明：中部叶成熟早期，不施生物炭处理的烟叶淀粉粒积累较多，但淀粉粒较小。而对碳氮代谢相关基因的表达分析显示：打顶后，糖、淀粉、代谢相关基因表达逐渐增强，氮代谢相关基因的表达逐渐减弱。添加300 kg/hm2和600 kg/hm2生物炭处理的相关基因表达整体较强。这说明添加生物炭后，糖、淀粉代谢相关基因表达更活跃。而对应的物质代谢分析表明，打顶及调制后，添加600 kg/hm2生物炭处理的淀粉含量较高。打顶后，添加生物炭后总糖、还原糖含量较低，但调制后，添加生物炭越多，总糖、还原糖含量也越高，由此说明添加生物炭有利于烟叶淀粉的积累和转化。添加生物炭后，烟叶的总氮、烟碱含量增加，且调制后的差异变小，这可能是添加生物炭后，活化了土壤养分，更利于营养物质的吸收及转化，进而最终改善烟叶品质。

[1] 高相彬,赵凤霞,孟智勇,等.碳氮代谢与烟叶品质的关系及其对氮素的响应研究进展[J].农学学报,2013(8):38-40.

[2] 史宏志,李志,刘国顺,等.皖南焦甜香烤烟碳氮代谢差异分析及糖分积累变化动态[J].华北农学报,2009，24(3)：144-148.

[3] 刘国顺,彭钾良,黄无炯,等.N、P互作对烤烟碳氮代谢关键酶活性的影响[J].中国烟草学报,2009,15(5):33-37.

[4] 樊武广,王振海,牛书金,等.不同氮源对烤烟碳氮代谢关键酶和化学成分的影响[J].江西农业学报,2012,24(10):50-52.

[5] 杨永霞,石冰瑾,王霄龙,等.不同海拔高度的烤烟淀粉合成动态研究[J].湖南农业大学学报：自然科学版,2012,38(1):22-26.

[6] 张海伟,何宽信,程小强,等.水氮运筹对紫色土旱地烤烟碳代谢生长及品质的影响[J].华北农学报,2015,30(2):227-231.

[7] 许晨曦,刘国顺,李向阳,等.品种与施氮量互作对烟草碳氮代谢关键酶的影响[J].江苏农业科学,2012,40(3):83-85.

[8] 王寒,林锐锋,彭琛,等.采收时间对烤烟碳氮代谢关键酶活性和烟叶化学成分的影响[J].烟草科技,2013(3):79-84.

[9] 张玲,翟欣,许自成,等.不同烤烟品种碳氮代谢关键酶和品质指标比较[J].贵州农业科学，2014,42(2):52-55.

[10] 刘典三，黄锡春，肖先仪,等.生物炭固定化缓控释肥对烤烟生长发育及品质的影响[J].江西农业学报，2014,26(12)：28-31.

[11] 李雪利,叶协锋,顾建国,等.土壤C/N比对烤烟碳氮代谢关键酶活性和烟叶品质影响的研究[J].中国烟草学报,2011，17(3):32-36.

[12] 李祖良,刘国顺,腊贵晓,等.成熟期短时渍水胁迫对烤烟碳氮代谢关键酶及主要碳氮化合物含量的影响[J].华北农学报，2012,27(2):175-179.

[13] 赵宪凤,刘卫群,王树会.氮、磷、钾对烤烟碳氮代谢关键酶活性及其经济效益的影响[J].华北农学报,2012,27(4):181-185.

[14] 云菲,刘国顺,史宏志.光氮互作对烟草气体交换和部分碳氮代谢酶活性及品质的影响[J].作物学报,2010,36(3):508-516.

[15] Van Z L, Kimber S, Morris S, et al. Effects of biochar from slow pyrolysis of papermill waste on agronomic performance and soil fertility[J]. Plant and Soil, 2010, 327(1/2): 235-246.

[16] 卜晓莉,薛建辉.生物炭对土壤生境及植物生长影响的研究进展[J].生态环境学报，2014,23(3):535-540.

[17] Antal M J, Gronli M. The art, science and technology of charcoal production[J]. Ind Eng Chem Res, 2003, 42(8): 1619-1640.

[18] Barnes R T, Gallagher M E,Masiello C A, et al. Biochar-induced changes in soil hydraulic conductivity and dissolved nutrient fluxes constrained by laboratory experiments[J]. PLoS One, 2014, 9(9): e108340.

[19] Singh B P, Cowie A L. Long-term influence of biochar on native organic carbon mineralisation in a low-carbon clayey soil[J]. Sci Rep ,2014, 4: 3687.

[20] 张伟明,孟军,王嘉宇,等.生物炭对水稻根系形态与生理特性及产量的影响[J].作物学报,2013,39(8):1445-1451.

[21] 王丽渊,丁松爽,刘国顺.生物质炭土壤改良效应研究进展[J].中国土壤与肥料,2014(3):1-6.

[22] 周震峰，王建超，饶潇潇.添加生物炭对土壤酶活性的影响[J].江西农业学报，2015,27(6)：110-112.

[23] Xu, H J, Wang X H, Li H, et al. Biochar impacts soil microbial community composition and nitrogen cycling in an acidic soil planted with rape[J]. Environ Sci Technol, 2014, 48(16): 9391-9399.

[24] Wei L, Wang. S T, Zhang J, et al. Biochar influences the microbial community structure during tomato stalk composting with chicken manure[J]. Bioresour Technol,2014, 154: 148-154.

[25] Yang F, Cao X, Gao B,et al. Short-term effects of rice straw biochar on sorption, emission, and transformation of soil NH-N[J]. Environ Sci Pollut Res Int, 2015, 22(12): 9184-9192.

[26] 万海涛,刘国顺,田晶晶,等.生物炭改土对植烟土壤理化性状动态变化的影响[J].山东农业科学,2014,46(4):72-76.

[27] 毛家伟,张翔,叶红朝,等.生物质炭对豫西烤烟生长、SPAD值及经济性状的影响[J].山西农业科学，2014,42(8):851-853.

Effects of Biochar on Carbon and Nitrogen Metabolism of Flue-cured Tobacco

ZHANG Jia-wei1, YANG Yong-xia1, FENG Xiao-hu2, JIA Hong-fang1,ZHANG Song-tao1, ZHANG Hong-ying1, Cui Hong1*

(1. Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;2. Fuzhou Tobacco Company of Jiangxi Province, Fuzhou 344000, China)

:In order to identify the effects of biochar on carbon and nitrogen metabolism of flue-cured tobacco, taking the tobacco variety (NicotianatabacumL, K326) as material, conducted the systematic research from the cell tissue structure, gene expression and metabolism in three levels. Results showed that the starch were more at the earlier stages, and degraded more completely in the treatment of no applying biochar with leaf maturity. The analysis of gene expression displayed that the expression of the genes related to carbon metabolism increased gradually after topping, while the expression of the genes related to nitrogen metabolism reduced. The expression of the genes were higher by applying more biochar at the later stages. The analysis of substance contents indicated that the contents of total sugar and reducing sugar reduced after applying biochar, the contents were higher after cured. The starch contents were higher after applying 600 kg/hm2. The contents of total nitrogen and nicotine increased after applying biochar, the difference was diminished after cured, these results showed that the metabolism of tobacco carbon and nitrogen were affected by applying biochar, thus affected the quality of flue-cured tobacco.

Flue-cured tobacco; Carbon and nitrogen metabolism; Biochar; Gene expression

2015-10-26

中国烟草总公司特色优质烟叶开发重大专项浓香型项目(110201101001 TS-01);江西烟叶物质代谢规律及调控研究(201201003)。

张嘉炜(1990─)，女，河南郑州人，硕士研究生，研究方向：烟草生物技术。*通讯作者：崔红。

S572

A

1001-8581(2016)03-0001-06

曾小军)