miRNA-34c在鼻咽癌组织中的表达及意义

魏贝　曹华

(郑州大学第一附属医院 耳鼻咽喉头颈外科　河南 郑州　450052)



miRNA-34c在鼻咽癌组织中的表达及意义

魏贝曹华

(郑州大学第一附属医院 耳鼻咽喉头颈外科河南 郑州450052)

【摘要】目的检测miRNA-34c在鼻咽癌组织中的表达情况，并探讨其在鼻咽癌发生、发展中的意义。方法以实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法检测28例鼻咽癌石蜡包埋组织中相对于28例鼻咽部慢性炎症石蜡包埋组织中miRNA-34c的差异表达情况，并结合临床资料及随访结果分析miRNA-34c与鼻咽癌病例临床因素的相关性。结果鼻咽癌组织中miRNA-34c的相对表达量明显低于鼻咽部慢性炎症组织，差异有统计学意义(P<0.05)。且随着临床分期的增高、淋巴结转移，miRNA-34c的表达呈下降趋势。结论miRNA-34c可能参与鼻咽癌的发生与发展，调控miRNA-34c的表达量有望为鼻咽癌的治疗提供一种新的思路或方法。

【关键词】鼻咽癌；miRNA-34c；表达

鼻咽癌是我国高发恶性肿瘤之一，临床多采用以放射治疗为主的综合性治疗。局部复发和远处转移是治疗失败的主要原因。洪海裕等[1]通过临床观察发现鼻咽癌5 a无局部复发率、无远处转移率、总生存率分别为85.1%、88.31%和85.71%。早发现、早治疗对提高患者的生存率有重要意义。miRNA作为新一代肿瘤诊断和分子靶向治疗的标志物成为研究热点。大量实验研究证实，miRNA可作为肿瘤诊断、预后评估的一种重要生物标志物，包括乳腺癌[2]、结肠癌[3]、前列腺癌[4-5]、肝细胞癌[6]、胃癌[7-8]、肾癌[9]、鼻咽癌[10]等。miRNA-34c是miRNA-34家族中的一员，miRNA-34家族的表达可在不同细胞环境中引起细胞G0/G1期的阻滞。如果能在鼻咽癌组织中检测到miRNA-34c表达的变化，将给鼻咽癌的早期诊断提供一定的帮助。本研究以鼻咽癌石蜡包埋组织为研究对象，利用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)方法对miRNA-34c在鼻咽癌石蜡包埋组织相对于鼻咽部黏膜慢性炎组织中的差异表达进行检测，并对其表达量与鼻咽癌各项临床因素的相关性进行分析。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1标本收集搜集整理郑州大学第一附属医院2011年4至2013年3月28例初诊为鼻咽癌患者的石蜡包埋组织，均经病理证实为低分化非角型鳞状细胞癌。28例鼻咽癌病例年龄19～73岁(中位年龄45岁)，男19例(67.9%)，女9例(32.1%)。根据 UICC 第7版/2010鼻咽癌分期标准：Ⅰ期5例、Ⅱ期8例、Ⅲ期10例、Ⅳ期5例；M021例、M17例。对照组为同期28例病理诊断为鼻咽部黏膜慢性炎患者，年龄33～48岁(中位年龄43岁)，其中男18例(64.3%)，女10例(35.7%)。两组年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)。

1.1.2实验主要试剂及引物序列石蜡包埋组织miRNA提取试剂盒购于北京天根生物有限公司，逆转录PCR试剂盒购于Applied Biosystems公司，qRT-PCR试剂盒购于Vazyme公司，反应体系及实验流程均参照试剂盒说明书完成。依据miR Base数据库16.0中人源miR-34c(has-miR-34c-5p)的基因序列，由生工科技设计Q-PCR所需要的miR -34c特异性引物以及内源性参照U6的引物，并由金维智生物科技公司合成。见表1。

表1　引物序列表

1.2方法

1.2.1总miRNA提取总miRNA的提取依照北京天根科技有限公司石蜡包埋组织miRNA提取试剂盒(DP502)说明书严格进行。

1.2.2miRNA反转录按照Applied Biosystems公司TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription Kit(4366596)说明书进行。反应体系为15 μl。dNTP mix 1 μl，MiltiScribeTMRT enzyme 1 μl，10×RT buffer 0.15 μl，RNase Inhibitor 0.19 μl；茎环引物3 μl，Total RNA 360 ng，加水至15 μl。将上述反应体系充分吹打混匀，避免产生气泡。于StepOne扩增仪上16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min进行反应，合成的cDNA进行下一步实验或于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.3miRNA的RT-PCR反应miRNA的qRT-PCR反应使用反转录试剂盒进行，并以小核RNA U6为内参照进行qqRT-PCR。反应体系为20 μl，每个样品重复3次。AceQ®qPCR SYBR®Green Master Mix 10 μl，正向引物0.4 μl，反向通用引物0.4 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl反向引物1 μl。cDNA 2 μl，加水至20 μl。StepOne Plus仪上95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，40个循环。

1.2.4实验结果数据处理qRT-PCR以小核RNA U6为内参照，对目标基因进行归一化处理，比较各样品中目标基因的表达量。用2-△△Ct方法[14]统计实验结果：鼻咽癌组miR-34c△Ct均值=鼻咽癌组miR-34cCt均值-鼻咽癌组U6Ct均值，正常组miR-34c△Ct均值=正常组miR-34cCt均值-正常组U6Ct均值，△△Ct均值=鼻咽癌组miR-34c△Ct均值-正常组miR-34c△Ct均值，2-△△Ct表示相对于正常组，鼻咽癌组患者石蜡包埋组织中miR-34c的相对表达量(均值是平行重复实验时，同一样本在两个反应管中反应所得的基因Ct值的均值，目的是为了消除加样量误差，U6作为阳性内参照基因，用来矫正Q-PCR所扩增基因的拷贝数)。

2结果

2.1总miRNA质量检测总miRNA的浓度为103～434 ng/μl，满足实验要求。RNA吸光值的比值满足1.80

2.2鼻咽癌组与正常组miRNA-34c表达量比较 鼻咽癌组miRNA-34c相对表达量为(0.268±0.087)。鼻咽癌组石蜡包埋组织中miR-34c表达量明显低于对照组(P<0.05)。

2.3鼻咽癌组中各亚组间miRNA-34c相对表达量比较不同年龄及性别亚组miRNA-34c相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)；Ⅲ、Ⅳ期亚组miRNA-34c相对表达量较Ⅰ、Ⅱ期明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；有淋巴结转移亚组miRNA-34c相对表达量较无淋巴结转移亚组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　 鼻咽癌各亚组间miRNA-34c相对表达量的比较

3讨论

鼻咽癌是发生于鼻咽顶壁与后壁交界处的恶性肿瘤，与吸烟、遗传、EB病毒感染、环境等多种因素密切相关。鼻咽癌的发生、发展过程中存在癌基因的激活和抑癌基因的失活。微小RNA是一类高度保守、长度20～24个核苷酸的非编码单链小RNA。已有研究表明，人类miRNA的编码基因结合位点有700多个。据估计，近1/3的人类基因表达受miRNA的调控。miRNA既可作为抑癌基因下调原癌基因的活性，也可作为癌基因下调抑癌基因的活性，还可调节肿瘤相关基因的表达。其自身突变、缺失、易位及相互调控异常等可导致相关基因的异常表达。多基础研究一直在致力于寻找不同肿瘤的特异性miRNA表达谱。肿瘤特异性的miRNA表达谱不仅可以找寻低分化肿瘤的原发灶，而且对确定组织来源并制定个体化治疗方案大有裨益。随着研究的深入，学者们发现不同的肿瘤中miRNA表达谱也不尽相同，miRNA-34家族中的miRNA-34b/c与miRNA-34a的功能相似，miRNA-34a在各组织中均有表达，而miRNA-34b/c主要在输卵管、睾丸、肺及气管中表达[11]，其启动子区域在转移性癌细胞株中呈表观遗传学沉默。诸多实验研究结果显示：与正常组织对比，miRNA-34c在诸如结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌及卵巢癌等恶性肿瘤中均呈下调表达，尤其是头颈鳞状细胞癌[12-13]。已有研究证实，miRNA作为肿瘤标志物比蛋白质更为灵敏，在石蜡包埋组织中依然相当稳定，是用于筛选鉴别生物标志物取材的理想选择[14]。然而，对于miRNA-34c，既往研究多是以肿瘤细胞系为研究对象，对于人类鼻咽癌低分化鳞状细胞癌实体肿瘤中miRNA-34c差异表达的相关报道相对较少。本研究通过提取石蜡包埋组织中的miRNA，并以实时荧光定量技术检测miRNA-34c的相对表达量。结果显示，鼻咽癌组织中miRNA-34c的相对表达量明显低于正常组织；有淋巴结转移的病例miRNA-34c的相对表达量明显低于无淋巴结转移的病例；随着病理分期的增加，miRNA-34c的表达量呈下降趋势。这与相关研究[15-17]结果基本相符。以上研究表明，miRNA-34c参与了鼻咽癌的发生、发展，调控其表达量有望为鼻咽癌的治疗提供一种新的思路或方法，但具体机制尚需进一步的研究。

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The expression and significance of miRNA-34c in patients with nasopharyngeal carcinoma

Wei Bei, Cao Hua

(DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckOncology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityy,Zhengzhou450052,China)

【Abstract】ObjectiveTo detect the expression of miRNA-34c in nasopharyngeal carcinoma tissues, and investigate the significance in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma. MethodsThe relative expression of miRNA-34c in 28 cases of nasopharyngeal carcinoma with respect to 28 cases of chronic nasopharyngeal flammation tissues were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The correlation of miRNA-34c and clinicopathological parameters were analyzed with the clinical and follow-up data. ResultsThe relative expression of miRNA-34c in nasopharyngeal carcinoma tissues was lower than the chronic nasopharyngeal inflammation tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05). With the increasing of clinical stages and lymph node metastasis, miRNA-34c expression was on the decline. ConclusionmiRNA-34c may participate in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma. Regulating the expression of miRNA-34c volume is expected to provide new train of thought or method in the treatment of nasopharyngeal carcinoma.

【Key words】nasopharyngeal carcinoma; miRNA-34c; expression

(收稿日期：2015-10-24)

【中图分类号】R 739.6

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.03.005

通讯作者：曹华，E-mail：951996078@qq.com。