基因芯片筛选原发性肝癌患者的差异表达基因

董亚辉　宋展

(1.新乡医学院　河南 新乡　453000； 2.南阳市中心医院 普外科　河南 南阳　473009)



·论著·

基因芯片筛选原发性肝癌患者的差异表达基因

董亚辉1宋展2

(1.新乡医学院河南 新乡453000； 2.南阳市中心医院 普外科河南 南阳473009)

【摘要】目的利用基因表达谱芯片技术探讨原发性肝癌(PHC)不同阶段(癌组织、癌旁组织、正常组织)差异基因的表达，进一步寻找PHC不同阶段组织中的差异表达基因。方法提取20例肝癌癌组织、癌旁组织和正常组织的总RNA，应用Agilent人类全基因组4×44K基因芯片筛选差异表达基因，采用微阵列类分析(SAS)软件对芯片图像进行分析。结果筛选出癌组织与正常组织差异基因4 175个，其中上调基因1 850个，下调基因2 325个。对筛选出的差异基因进行GO分类，主要分为催化活性、信号转导、酶活性调节、转录活性调节、蛋白运输功能、细胞生长、凋亡等功能过程。结论利用基因芯片技术可高通量地筛选出PHC不同阶段组织的差异表达基因，为进一步阐明PHC的发生机制提供实验依据。

【关键词】肝癌；基因表达谱；基因芯片

原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)是常见的消化系统恶性肿瘤，号称癌症之王，发病率逐年增长，目前已超过62.6万/a，死亡接近60万/a，位居恶性肿瘤死亡率的第3位。肝癌在我国高发，目前我国发病人数约占全球的55%[1-2]。流行病学调查显示，我国沿海地区肝癌的发病率高于内地，且男性高于女性。近年来基因芯片技术在肿瘤研究中逐渐得到广泛应用，为我们在分子水平研究肝癌的发病机制提供了一条新途径。本研究通过基因表达谱芯片技术对PHC的基因表达谱进行分析，通过癌组织与癌旁组织、正常组织对比，筛选差异表达基因，以寻找与肝癌发生发展有关的基因，以利于全面了解肝癌的发病机制，为肝癌的诊断和治疗提供新途径。

1资料与方法

1.1研究对象选择南阳市中心医院普外科2014年1月至2014年12月经病理证实为PHC的20例住院患者，其中男15例，女5例，年龄54～76岁，中位年龄66.24岁。所有患者均有详细的临床资料，术前均未接受放化疗，在手术和采集标本前均签署书面知情同意书。手术切除肿瘤后立即取新鲜组织(癌组织、癌旁组织、正常组织)，切成约1 cm小块，PBS溶液漂洗后迅速投入液氮中保存。

1.2检测方法

1.2.1RNA抽提和纯化采用TRIZOL Reagent方法，根据厂商提供的标准操作流程进行样品总RNA抽提，抽提所得总RNA经安捷伦生物分析仪电泳质检合格后使用RNA纯化试剂盒及DNA酶消化试剂盒纯化总RNA。

1.2.2样品RNA放大和标记样品RNA采用安捷伦表达谱芯片配套试剂盒：快速标记低输入试剂盒(单色，货号5190-2305，安捷伦科技，美国)。按照标准操作流程对样品总RNA中的mRNA进行放大和标记，并用纯化试剂盒(货号74106，QIAGEN，德国)纯化标记好cRNA。

1.2.3芯片杂交使用安捷伦表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒：基因表达杂交试剂盒(货号5188-5242，安捷伦科技，美国)在滚动杂交炉(货号2545A，安捷伦科技，美国)中滚动杂交17 h(65 ℃，10 rpm)，杂交cRNA，并在洗缸中洗片，所用试剂为基因表达的洗涤液套装(货号5188-5327，安捷伦科技，美国)。

1.2.4结果扫描采用安捷伦微阵列扫描仪软件对完成杂交的芯片进行扫描，用Feature Extraction software软件读取数据，Gene Spring Software 11.0进行归一化处理。

1.2.5生物信息学分析用上海伯豪生物技术有限公司提供的在线分析软件SAS进行统计学分析[3-5]，最后将筛选出来的差异基因进行基本信息注释、Gene Ontology(GO)分析、找出基因相对应的通路，并对以上资料进行归纳、整理和分析。

2结果

A260/A280比值是一种检测RNA纯度的方法，正常范围为1.8～2.1。本样品A260/A280比值为1.87～2.18，说明总RNA的纯度较高。本样品均符合以上质检标准。

通过SAS软件，将20例肝癌癌组织和正常组织表达谱进行组间比较，以P-values<0.01和Fold Change>2或<0.5标准筛选出癌组织与正常组织差异基因4 175个，其中有1 850个上调基因，2 325个下调基因；以Fold Change>10或<0.1标准筛选出癌组织与正常组织显著差异基因39个，其中有28个上调基因(表1)，11个下调基因(表2)。

对筛选出的癌组织与正常组织差异基因进行GO分类，其中数据库(Gene Bank)中存在的已知基因3 471个。GO分类将3 471个已知基因按分子功能(molecular function，MF)进行分类，发现这些有差异表达的基因与分子转运、结合、催化活性、结构分子活性、转录活性调节、酶活性调节、蛋白运输等有关。

表1　显著上调的差异表达基因

表2　显著下调的差异表达基因

对表达显著的29个差异基因的信号通路分析后发现，与上述分析的信号传导通路有所不同，其主要传导通路为Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)、MAPK signaling pathway和Calcium signaling pathwaym，并分析了表达显著的29个差异基因在通路中涉及到的作用主要为细胞发育、免疫系统、信号分子与互动、细胞复制和修复、炎症反应等。

3讨论

目前，肝癌的病因及发病机制尚不明确，而且尚未找到与肝癌相关的特异性分子，给预防和治疗带来了很大困难，发病率和死亡率居高不下。过去对PHC的发病机制研究往往针对1个或几个基因，由于免疫组化、Southern、Northern等杂交技术无法满足大规模、高通量的杂交要求，所以高通量基因表达谱芯片是目前筛选特定肿瘤发生、发展和转移等病理过程所有基因表达最有效的方法。

本研究使用人类全基因组表达谱芯片对PHC癌组织、癌旁组织和正常组织进行检测，通过对其基因表达差异分析，寻找相关差异表达基因。筛选出相关差异表达基因4 175个，其中有1 850个上调基因(显著上调28个)，2 325个下调基因(显著下调11个)。这些基因功能涉及到了细胞生命的各个方面，数千个上调和下调基因参与了PHC的癌变过程，其中功能未详的基因也参与了这一过程，而差异表达显著的基因很有可能是在调控PHC的临床生物学方面起到了主导作用。

通过本研究结果分析发现，在PHC中存在大量差异表达基因，这些差异基因中有许多已经被证实和恶性肿瘤的发生、发展有关系，同时也发现许多新的异常表达基因，而这些异常表达的基因参与了多种分子生物学过程。它们之间相互影响，有着复杂的网络关系，并在恶性肿瘤的不同时期发挥着不同的作用，使得细胞的增殖、分化、凋亡发生转变。这也说明了肝癌的发生、发展是一个多因素的过程，虽然涉及到许多基因，但其中相当一部分可能是继发性改变，所以只有进一步筛选出关键的基因或信号通路，才有可能为疾病的诊断、治疗提供有效的指导，但是从基因到蛋白质要通过转录、翻译、加工修饰才有活性，所以还需要将两者相结合，才能更加准确地阐释完整的病理过程[6]。

参考文献

[1]Rampone B,Schiavone B,Martino A,et al.Current management strategy of hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2009,15(26):3210-3216.

[2]韩霜.血清AFP、CA125、CA199联合检测在原发性肝癌中的诊断价值[J].河南医学研究,2015,24(1):100.

[3]Tusher V G,Tibshirani R,Chu G.Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(9):5116-5121.

[4]Rodgers J L,Nicewanger W A.Thirteen ways to look at the correlation coefficient[J].The American Syayistician,1988,42(1):59-66.

[5]Stigler,Stephen M.Francis Galton’s Account of the Invention of Correlation[J].Stat Sci,1989,4(2):73-79.

[6]岳静宇.不同证候食管癌差异表达基因研究[D].郑州:河南中医学院,2012.

Screening differential expression genes of primary hepatocellular carcinoma patients by gene chip technology

Dong Yahui1，Song Zhan2

(1.XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453000,China; 2.DepartmentofGeneralSurgery,NanyangCentralHospital,Nanyang473090,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the related gene expression in hepatic carcinoma of different stages (cancerous tissue, paraneoplastic tissue, normal tissue) by cDNA expression profiling microarray technique, and to further seek differentially expressed genes of hepatocellular carcinoma tissue in different stages. MethodsThe whole RNA of 20 cases of cancerous tissue, paraneoplastic tissue, normal tissue of hepatic carcinoma was extracted. Agilent human genome 4×44K gene chip was applied to screen differentially expressed genes, and microarray analysis software (SAS software) was used to analyze chip image. Results4 175 kinds of differentially expressed genes of cancerous tissue and normal mucosa tissue were screened, among which, there were 1 850 kinds of up-regulated genes and 2 325 kinds of down-regulated genes. Then through GO classification, screened differentially expressed genes mainly were divided into the following function and process: catalytic activity, signal transduction, enzymatic activity regulation, transcription activity regulation, protein transportation function, cell growth and apoptosis, and so on. ConclusionGene chip technology can high-throughput screen differentially expressed genes of hepatocellular carcinoma in different stages, and provide experimental basis for further expounding the occurrence mechanism of hepatocellular carcinoma.

【Key words】hepatic carcinoma; gene expression profiling; gene chip

(收稿日期：2015-11-06)

【中图分类号】R 735.7

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.03.003

通讯作者：宋展，E-mail：songzhanny@163.com。