氨基酸及溶剂环境对牛骨胶原热稳定性的影响

刘丽莉，尹光俊，康怀彬，李　丹，王　焕

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)



氨基酸及溶剂环境对牛骨胶原热稳定性的影响

刘丽莉，尹光俊，康怀彬，李丹，王焕

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

摘要：以牛骨为原料提取酸溶胶原蛋白(acid soluble collagen，ASC)和酶溶胶原蛋白(pepsin soluble collagen，PSC)，分别测定其热变性温度并分析其氨基酸组成与分布。再以牛骨PSC为对象，研究了胶原所处溶剂环境(含水量、离子强度和pH值)对胶原热稳定性的影响。研究结果表明：牛骨ASC和PSC的热变性温度分别为70.30 ℃和69.93 ℃，均接近标准品，且在氨基酸组成与分布上相似。胶原蛋白中的亚氨酸和碱性氨基酸质量分数越高，胶原的热稳定性越强。在一定范围内，随着胶原含水量的增加，其热稳定性降低。在离子强度较低的体系范围内，胶原的热变性温度随着离子强度的增加而降低。当溶剂体系pH值为6.0时，胶原热稳定性最强。随着pH值继续升高或降低，热稳定性均降低。当pH值过高或过低时，热变性峰呈变小甚至消失趋势，胶原发生变性。

关键词：氨基酸；胶原蛋白；热稳定性；离子强度

0引言

胶原蛋白是以三股螺旋结构聚合而成的纤维蛋白质，主要存在于鱼类及畜禽的皮、骨等副产物中。根据胶原蛋白的结构差异，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等多种类型，其中，以Ⅰ型为主要存在形式[1-2]。因其具有良好的生物相容性，已广泛应用于医药、化妆品和食品等领域中[3]。胶原受热后不稳定，三螺旋结构解体，形成特殊的伸展结构，即胶原的热变性过程[4-5]。胶原热变性后，所具备的部分功能特性也随之降低或消失，因此，探究胶原的热稳定性及其影响因素具有重要意义。

牛骨中的Ⅰ型骨胶原，不但含量丰富且所含氨基酸(amino acid,AA)种类齐全，是一种营养全面的优质蛋白质[6]，因此，对牛骨胶原的提取及深加工已成为近几年的研究热点。文献[7]采用中性蛋白酶和风味蛋白酶分步酶解牛骨，研究了复合酶分步酶解提取牛骨胶原的最佳工艺。文献[8]利用蛋白酶酶解法提取了牛骨胶原多肽，再对酶解后的骨渣进行酸处理提取可溶性骨钙，并与胶原多肽螯合，成功制得了牛骨胶原多肽螯合钙。同时，针对胶原的热稳定性研究也日益增多。文献[9]研究发现不同来源的Ⅰ型胶原在热稳定性能上存在差异，说明除分子构象外，胶原化学组成亦是影响其热稳定性的重要因素。文献[10]以两种淡水鱼皮为原料酶解提取胶原蛋白，并进行胶原蛋白分子结构和热稳定性的分析，发现不同提取来源的胶原蛋白具有相似的二级结构，但在氨基酸组成及热稳定性上均存在显著差异。但目前针对热稳定性研究的胶原都提取自鸡骨、猪皮和鱼皮等，针对牛骨胶原热稳定性的研究还较少。因此，本文以牛骨为对象，研究了氨基酸及溶剂环境对牛骨胶原热稳定性的影响，为牛骨胶原的开发利用提供依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

将新鲜牛骨充分洗涤并冻藏备用；羟脯氨酸标准品(质量分数≥99%)，上海康达氨基酸厂生产；胃蛋白酶，丰达生物科技有限公司生产；氢氧化钠，天津市德恩化学试剂有限公司生产；氯化钠，江苏强盛功能化学股份有限公司生产；乙酸(质量分数为99.99%)、盐酸(质量分数为36%)、乙醚(质量分数为99.99%)和石油醚均由洛阳昊华化学试剂有限公司生产。

1.2仪器与设备

LGJ-10D型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂生产；835-50型氨基酸分析仪，日本日立公司生产；DSC823e型差示扫描量热仪，梅特勒-托利多公司生产；DYY-12型电泳仪，北京六一仪器厂生产。

1.3试验方法

胶原蛋白的所有提取和纯化步骤均在温度低于10 ℃的环境下完成。将修整洗净的牛骨进行超微粉碎，在V(无水乙醚)∶V(石油醚)=1∶1的溶液中浸泡24 h，脱脂后用去离子水反复洗涤、沥干；随后，用体积分数为0.5%的盐酸溶液浸泡48 h脱钙，去离子水洗涤、沥干后，用0.5 mol/L乙酸溶液摇浴24 h，离心分离上清液得到酸溶胶原蛋白(acid soluble collagen,ASC)粗提液。沉淀物继续用含2%(质量分数)胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸溶液摇浴24 h，分离上清液得到酶溶性胶原蛋白(pepsin soluble collagen,PSC)粗提液。

分别向ASC和PSC粗提液中添加氯化钠至其浓度为0.9 mol/L，4 ℃盐析24 h后过滤。所获胶原蛋白沉淀用0.5 mol/L乙酸溶液复溶，离心(8 000 r/min，10 min)，上清液再次盐析、乙酸复溶(重复3次)，最后得到的离心上清液依次经0.1 mol/L的乙酸溶液及蒸馏水透析后，冷冻干燥得到纯化的胶原蛋白样品。参照文献[11]的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对提取的产品进行分析，得出提取物为保持完整三股螺旋结构的Ⅰ型胶原蛋白。

采用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)测定胶原样品的热变性温度Td。称取胶原样品5 mg加入DSC铝坩埚中并加盖密封，测定前仪器用金属铟进行校正，用空铝盒作对照。扫描温度为20～100 ℃，升温速率为5 ℃/min，样品室氮气流速为40 mL/min。

胶原蛋白样品在密闭充氮条件下，用6 mol/L盐酸于110 ℃水解24 h，随后用氨基酸自动分析仪测定蛋白质氨基酸组成。

为了考察溶剂环境对胶原热稳定性能的影响，以牛骨PSC样品为测试对象，采用DSC法(扫描温度20～180 ℃，升温速率5 ℃/min)测定胶原热变性温度，分别改变体系的含水量、pH值和离子强度等溶剂环境条件，研究胶原热稳定性能的改变。

(1)含水量的影响：称取一定量胶原样品添加去离子水溶胀，分别测定溶胀2 d、3 d、4 d、5 d和6 d后胶原的热变性温度。同时，以冻干牛骨PSC作为对照样品，不加水溶胀直接测定。

(2)pH值的影响：以去离子水为溶胀剂，分别用0.5 mol/L的盐酸调节溶胀剂体系pH值为7.0、6.0、5.0、4.0和3.0，在4 ℃条件下将胶原样品溶胀3 d后测定热变性温度。

(3)离子强度的影响：以去离子水为溶胀剂(pH=7.0)，以氯化钠作为离子强度调节剂，调节溶胀剂体系离子强度分别为20 mmol/L、50 mmol/L、200 mmol/L和300 mmol/L。同时以不添加氯化钠的溶液作为对照组，在4 ℃条件下将胶原样品溶胀3 d后，分别测定不同离子强度下的热变性温度。

2结果与分析

2.1牛骨胶原蛋白热变性温度图谱分析

对牛骨中提取的ASC和PSC进行差示扫描量热分析，并与牛腱Ⅰ型胶原标准品对比，结果如图1和图2所示。在天然状态下，胶原是由三条肽链缠绕成的一个超螺旋结构，加热时其氢键断裂，最终导致胶原蛋白三股螺旋链被破坏，由伸展的纤维状态转变成无规则卷曲状态，并伴随能量变化，因此，胶原蛋白的热变性温度是反映其天然螺旋结构的一项重要指标，主要用于表达胶原蛋白的热稳定性[12]。由图1和图2可知：牛骨ASC和PSC分别在70.30 ℃和69.93 ℃出现了吸热峰，此时胶原蛋白已经完全变性。对比标准牛腱Ⅰ型胶原、PSC和ASC的DSC图谱可以看出：三者的热变性温度基本接近，与已报道的鱼类、牛皮和猪皮中所提取胶原蛋白的热变性温度相比明显较高。经图谱分析表明：牛骨胶原蛋白样品较好地保持了胶原蛋白的三螺旋结构，且相对于牛骨PSC而言，牛骨ASC结构更稳定。

图1 牛骨酸溶胶原蛋白的差示扫描量热分析图2 牛骨酶溶胶原蛋白的差示扫描量热分析

2.2氨基酸组成对胶原热稳定性的影响

一般蛋白质含有20种氨基酸，胶原含有18种氨基酸，且有特别的组成。胶原的变性是指三螺旋结构之间的氢键断裂，螺旋解开，形成单链无规则的线团结构，进而发生性质的改变[13]。表1为牛骨胶原氨基酸组成，其中，所有胶原样本的氨基酸组成均符合天然胶原的氨基酸组成特征，即除含有特征性氨基酸(羟脯氨酸)外，还富含甘氨酸、脯氨酸和谷氨酸，而甘氨酸质量分数占总氨基酸的1/3以上。这也进一步证明了提取的牛骨胶原蛋白为典型的具有完整三螺旋结构的Ⅰ型胶原蛋白。由表1可知:牛骨胶原氨基酸组成中亚氨酸质量分数丰富，且亚氨酸和碱性氨基酸质量分数在牛骨ASC中最高，牛骨PSC次之，标准品最低;而相应的热变性温度也为牛骨ASC最高，标准品最低。说明牛骨胶原蛋白的热变性温度与亚氨酸和碱性氨基酸质量分数存在一定相关性，这与文献[14]关于脊椎动物胶原蛋白的热稳定性与亚氨酸质量分数呈正相关的研究结论相符。相比之下，水产胶原蛋白的亚氨酸质量分数则偏低，其热稳定性也普遍较差，如草鱼皮胶原的热变性温度仅为28.4 ℃。对于牛骨胶原蛋白，亚氨酸和碱性氨基酸的质量分数越高，其热稳定性越强。

表1　胶原氨基酸(AA)组成及质量分数分析

注：亚氨酸=脯氨酸+羟脯氨酸;碱性氨基酸=赖氨酸+精氨酸+组氨酸。

2.3溶剂环境对胶原热稳定性能的影响

胶原分子内的少量水分子可在三条肽链之间起到氢键纽带作用，从而稳定胶原分子的三螺旋结构。文献[15]研究了尿素和n-丙醇对鼠尾腱胶原蛋白黏度变化及变性温度的影响，指出胶原的热变性温度取决于含水量、介质pH值和胶原自身的交联度。图3是干燥牛骨PSC样品的差示扫描量热分析曲线，吸热峰出现在140.30 ℃。图4是牛骨PSC经水溶胀的热变性温度变化曲线。由图4可看出：溶胀后，胶原热变性温度降低。这是由于干燥样品中不存在游离态水的介入，胶原分子间结合更为紧密，胶原三螺旋分子间的结构也更稳定。当胶原经水溶胀后，游离水分子进入胶原样品内部，胶原分子间的结合结构被破坏，从而导致胶原三螺旋结构稳定性降低，热稳定性下降。同时，随着溶胀时间的延长，胶原的热变性温度也呈明显下降趋势。溶胀2 d时，胶原热变性温度测定值为73.30 ℃；溶胀5 d时，其热变性温度降低至69.40 ℃；继续延长溶胀时间，胶原热变性温度不再降低，趋于稳定。

图3 干燥牛骨PSC的差示扫描量热分析图4 水溶胀对牛骨PSC热稳定性的影响

胶原构象的稳定性有赖于分子间和分子内的各种作用力的协同作用，酸、碱、热和照射等均能不同程度地削弱各种作用力，从而破坏胶原构象的稳定性。胶原的变性是其构象的改变，并不伴随一级结构中肽键的断裂。利用差示扫描量热法测量蛋白变性过程时，只要条件一定，蛋白在 DSC 图上就有固定的吸热峰；如果蛋白在测定前已经变性，则吸热峰变小、位移或消失。图5是牛骨PSC样品在pH值分别为3.0～9.0的水溶液中溶胀后的热变性温度变化情况。由图5可知：当pH值为6.0时，热变性温度最高；而随着pH值的继续升高或降低，胶原的热变性峰值均越来越小，热稳定性减弱，说明H+和OH-对胶原热稳定性能均有负面影响。H+和OH-分别通过与胶原肽链内部的酸性氨基酸和碱性氨基酸竞争来减弱胶原内肽链间的电荷吸引作用，从而降低胶原热稳定性能；在强酸或强碱情况下，热变性峰值则呈消失趋势，与文献[16]报道的强酸、强碱环境会造成鲸鲨鱼皮胶原变性的研究一致。可能由于在极端pH值下，胶原分子间的交联键被破坏，最终导致胶原蛋白发生变性。

不同的离子强度会产生相应的电荷屏蔽效应，从而影响胶原分子间的静电作用。图6是牛骨PSC在不同浓度的氯化钠水溶液(离子强度0～300 mmol/L)中溶胀后DSC的测定结果。

图5 溶胀体系pH值对胶原热稳定性的影响 图6 溶胀体系离子强度对胶原热稳定性的影响

由图6可知：在较低浓度的氯化钠溶液中，胶原会发生轻微的膨胀；随着体系中离子强度的增加，胶原热稳定性随之降低，这可能是由于氯化钠与胶原蛋白分子骨架及侧链上的基团竞争水分子形成氢键，使得胶原蛋白的氢键易于被破坏；但随着体系离子强度的继续增加，胶原的热变性温度又迅速升高，这是由于胶原蛋白-盐的分级和聚合现象造成的。

3结论

(1)牛骨ASC和PSC的热变性温度分别为70.30 ℃和69.93 ℃，均与标准品接近。且热变性温度较高的牛骨ASC的氨基酸组成中，亚氨酸和碱性氨基酸质量分数最高，分别达到24.76%和12.77%，因此，针对牛骨胶原蛋白，亚氨酸和碱性氨基酸质量分数越高，胶原热稳定性越强。这说明氨基酸的组成及分布可能是影响胶原热稳定性的结构因素，氨基酸组成及分布改变，影响胶原分子肽键间的氢键和电荷相互作用，从而影响胶原结构的稳定性。

(2)随着胶原在水中溶胀时间的延长，胶原含水量增加，热稳定性呈减弱趋势。当溶剂体系pH值为6.0时，胶原热稳定性最强；随着pH值继续升高或降低，胶原的热变性峰值均变小甚至消失。在离子强度较低的体系内，胶原的热稳定性随着离子强度的增加而降低；进一步增加离子强度则可能会造成胶原的蛋白-盐的分级与聚合现象。这说明含水量、体系pH值和体系离子强度是影响牛骨胶原热稳定性的外部环境因素。

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中图分类号：TS251

文献标志码：A

收稿日期：2015-10-22

作者简介：刘丽莉(1974-),女,河南商丘人,副教授,博士,硕士生导师,主要从事生物技术和动物食品方面的研究.

基金项目：国家自然科学基金项目(31401622)

文章编号：1672-6871(2016)03-0073-05

DOI:10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2016.03.016