微生物挥发性有机物的检测及临床应用进展

张 晔，高红梅，陈文丽，谭青海 综述 张健鹏 审校

微生物挥发性有机物的检测及临床应用进展

张 晔，高红梅，陈文丽，谭青海 综述 张健鹏 审校

感染性疾病是威胁人类健康的重大疾病之一。目前感染性微生物的变异率越来越高，微生物种类越来越多，出现次数也愈加频繁，这些严峻的现实给病原微生物的鉴定提出了更大的挑战。因此，研究和发展一种实时、高效检测微生物挥发性有机物（microbial volatile organic compounds，MVOCs）的技术，快速鉴定病原微生物，对感染性疾病的早期临床治疗和预后有重要意义。笔者查阅相关文献，简要介绍了国内外几种常见检测MVOCs的方法及基本原理，对其近年来在感染性微生物鉴定中的最新应用研究进展进行综述，并展望其未来发展趋势。

微生物挥发性代谢产物；检测技术；微生物鉴定

MVOCs是微生物生长和发育过程中代谢产生的，并与其生长活动密切相关的，在常温常压下具有挥发性质的化合物[1-3]。目前检测MVOCs的方法主要有气相色谱法、质谱法、传感器或电子鼻法和光声光谱法等[1-3]。笔者就这几种常见的方法、基本原理及其近年来在感染性微生物鉴定中的最新应用研究进展综述如下。

1 气相色谱法

气相色谱法是Martin等[4]于1952年创立的一种以气体为流动相，采用冲洗法的柱色谱分离技术，其基本原理是汽化的样品从色谱柱入口进入载气气流中，连续经过色谱柱。色谱柱是一种涂有惰性载体的管子，样品中的各组分在柱内流动相和固定相之间进行分配而分离，最后得到样品的色谱图[4,5]。

1966年，Henis等[5]首次报导，使用气相色谱法检测细菌培养液，获得细菌各种代谢产物的色谱图，这些色谱图表现出了细菌属性或种的特征。Mitruka等[6]用气相色谱法分析了各种需氧菌培养物中的有机酸，根据有机酸色谱图的不同鉴别了多种革兰阴性和阳性需氧菌。随着气相色谱法的广泛应用，近期衍生出了裂解气相色谱法（pyrolysis gas chromatography，PGC），在使用流程上做了较大改进，并在一定程度上提高了其选择性和灵敏度[6,7]。周方等[7]用居里点裂解器-10型气相色谱仪和CDS型固体样品裂解器-Hewletr-Paekard 5840A报告式气相色谱仪对杆菌和弧菌的干燥菌粉、肠道杆菌新鲜培养物的水混悬液进行裂解鉴定，可根据其色谱图特征峰的不同对各种细菌进行区别。

气相色谱法是一种能高效分离复杂混合物，特别是低极性、热稳定性物质的技术。然而，其存在的主要缺点有：（1）待测物质必须通过乙醚等基质预先处理，变成气体；（2）操作过程较繁琐，且必须有预先标定的色谱柱，同时所有结果受操作过程影响较大，导致其灵敏度、选择性及稳定性均较差；（3）设备较昂贵。

2 质谱法

质谱法的基本原理是将待测物质离子化后通过适当的电场、磁场，由于其空间位置、时间或轨道等因素不同，导致质荷比分离，并按照质荷比的大小顺序排列[8]。离子化质谱是一种能产生带电荷的分子碎片并获得其质荷比，可以表征母体分子的化学结构，具有更高灵敏度和选择性的一种新型质谱技术。Dolch等[9]运用离子化质谱技术，将6种革兰阴性细菌（阴沟杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、产气克雷伯杆菌及沙雷氏菌）在营养肉汤液体培养液中培养，对产生的挥发性气体进行检测，通过主成分分析和聚类分析，将各细菌一一区别。目前在检测MVOCs方面，较常用的主要是离子质谱与其他技术联用的方法。

气相色谱与离子化质谱的有机结合在生物化学、医学、农业和环境等研究领域已得到广泛应用，是目前分析挥发性化合物的传统技术。气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）的基本原理是气化的样品在载气携带下流经色谱柱，根据其分配系数的不同先后从色谱柱流出，并进入质谱仪，进而得到各组分的质谱图[9]。

李绚梅和应可净[10]利用固相萃取及GC-MS技术研究了肺部感染几种常见致病菌，发现大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌的特征性挥发物分别是吲哚、十一烷醇、丁基羟基甲苯。Barbieri等[11]运用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（solidphase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GCMS）检测感染了巴氏葡萄球菌的块状松露，发现了45种细菌产生的有机挥发物。Matysik等[12]运用SPME-GCMS技术，成功区分几种霉菌属，并发现1，3-二甲氧基苯、2，4-戊二酮分别为杂色曲霉菌、抗性曲霉菌的特征挥发性产物。

然而，随着GC-MS技术被广泛地运用，该方法存在的一些问题也不容忽视：（1）分析化合物种类少，检测周期长；（2）获得的实验数据有时无规律或不理想；（3）在数据处理及分析时，不能较好地定量研究化合物的强度及从相应挥发性特征提取潜在生物信息等。

质子转移反应质谱（proton transfer reaction-mass spectrometry，PTR-MS）的基本原理是根据被测物的质子亲和力能高于水而低于高聚水的性质，使物质电离后多种挥发性有机物（volatile organic compounds,Vocs）能与H3O+进行质子转移反应，产生分子离子，根据其分子量信息，对混合物成分定性定量分析[13,14]。

Bunge等[15]运用PTR-MS很好地区分了大肠杆菌、福氏志贺菌、肠炎沙门氏菌、热带假丝酵母菌。Hara 等[16]将金黄色葡萄球菌分别接种在富含营养、葡萄糖及牛脑心培养液上，用PTR-MS进行连续检测，结果发现金黄色葡萄球菌产生的挥发性物质类型与培养液的类型关系不大，但是其浓度与时间密切相关。

选择离子流动管质谱（selective ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS）是一种选择离子流动管技术与质谱分析相结合的方法，其主要原理为水和空气经微波放电后，产生初始离子与待测气体进行反应，反应后的离子在分析器中进行质量分析。Thorn等[17]运用SIFT-MS联合矩阵分析、聚类分析及多元统计分析，成功将绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌等区别开来。

然而，SIFT-MS和PTR-MS仅适用于检测小分子MVOCs，并且需真空系统来维持离子反应区，导致其系统整体庞大，能量消耗较高。此外，由于离子之间的反应，不可避免地形成许多离子性簇化物（clusters）。因此，所获得的谱图趋于复杂，即使是专业人士，也较难准确解析质谱图。

相对上述质谱分析方法需在真空环境下操作，多毛细管柱离子迁移谱技术（multi-capillary column-ion mobility spectrometer，MCC-IMS）是一种可以在大气环境下工作，简便、快速、灵敏度高的新技术，其工作原理主要是：待测样品由载气（如空气、氮气等）带入电离反应区后，载气分子和样品分子在离子源的作用下发生电离反应和离子-分子反应，产生各种离子。在电场的驱使及与逆流的中性漂移气体分子不断碰撞过程中，这些离子根据各自迁移速率的不同，先后进入漂移区而被检测，见图1。

图1 多毛细管柱离子迁移谱技术装置原理[18]

Sasidhar等[19]利用MCC-IMS技术对大肠杆菌代谢产物进行检测。发现，乙醇、丙酮、庚烷-2-酮和2-壬酮四种代谢产物与其生长相关。此外，大肠杆菌数量与空间代谢物浓度之间呈正相关。Perl等[20]运用MCCIMS检测了烟曲霉菌及四种念珠菌的挥发性气体，通过分析3-辛酮、苯乙醇在各种微生物间的不同，能够明显区分曲霉菌和各种念珠菌，但不能有效进行念珠菌属之间的区分。Kunze等[21]运用MCC-IMS分析技术对在溶原肉汤液体培养液中培养的大肠杆菌和绿脓杆菌产生的挥发性气体进行检测，发现正癸醇、吲哚、辛烷单体及二聚体结构有助于鉴定大肠杆菌，而2-丙酮，氨二聚体、十二烷、乙基己醇等与绿脓杆菌鉴定相关。以上的研究表明，MCC-IMS是一种实时、快速检测微生物代谢产物的方法，在感染病原学领域具有一定的应用前景。

3 电子鼻法

电子鼻法是20世纪90年代发展起来的，以模拟人的嗅觉传导系统，进而检测待测物质的一种电子传感技术，其主要原理是，待测气体分子通过气味传感器阵列（初级嗅觉神经元），引起传感器阵列发生响应（即电信号），微弱的电信号经集成电路识别与放大（二级嗅觉神经元），最后由计算机分析软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚类分析（cluster analysis，CA）等处理，进而区分不同气体分子及细菌[22]。PCA主要是通过数据转换和降维传感器阵列响应的特征向量进行线性分类，并以PCA 散点图的形式展现，从而将原来许多变量重新组合成一组新的互相无关的几个综合变量。CA是按照物以类聚的原则，使特征向量矩阵置于一个多维空间中，将具有相似属性的变量聚为一类，并根据各自属性的不同进行区分[23,24]。

Parry等[24]利用电子鼻对腿部溃疡产生的特殊气味物质进行检测分析，可明确区分金黄色葡萄球菌和链球菌感染引起的溃疡。Setkus等[25]也对引起伤口感染的细菌挥发性代谢产物进行研究，能够确定伤口感染类型和感染阶段。Bruins等[23]通过使用一种称作mononose的电子鼻对37℃下培养6～8 h后的52株不同致病菌产生的挥发性气体进行检测。其中，艰难梭状芽胞杆菌的诊断特异性是100%，阴沟杆菌的特异性是67%，总的特异性是87%。邓高燕等[26]运用电子鼻法对5株单增李斯特菌和5株副溶血性弧菌的挥发性代谢产物进行研究，结合 PCA和 CA等化学分析方法进行处理，结果发现电子鼻能够很好地将5株单增李斯特菌的挥发性代谢产物图谱进行区分，而在同一技术条件下只能对5株副溶血性弧菌的挥发性代谢产物图谱进行部分区分。然而，若向这5株副溶血性弧菌的培养液中添加NaCl至饱和，则可完全区分这5株细菌。

胡惠平等[2]利用电子鼻和顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS）对3株从猪肉中分离的假单胞菌在胰酪胨大豆肉汤（trypticase soy broth，TSB）纯培养条件下产生的挥发性代谢产物进行检测分析，成功区分3 株假单胞菌，并发现这3株细菌产生的挥发性物质各不相同。陈雪等[27]采用GC-MS技术与电子鼻技术对5种常见李斯特属细菌的挥发性代谢产物进行定性及相对定量研究，获得李斯特菌共有的挥发性化合物和特有的化学物质，有望用来作为单增李斯特菌鉴定的依据。

由于电子鼻结构的特殊性，它只能对整体混合物的挥发性特征做出作出分析，很难对单独的挥发性成分做出具体分析。同时受到传感器灵敏度、模式识别等技术方面影响，电子鼻在低浓度的挥发性物质检测中受到一定限制，更无法进一步进行定量分析，因此，电子鼻目前仅用于辨识或检测一种挥发性成分或少数几种挥发性成分的混合物。对于典型挥发性成分的确定或复杂挥发性成分体系的分析，电子鼻的使用受到明显限制[28]，且这些研究尚处于试验研究阶段，对微生物鉴定的灵敏度、稳定性及选择性仍不容乐观，这在一定程度上阻碍了其在临床中的应用。

4 光声光谱法

光声光谱法是建立在光声效应基础上，反映物质与光相互作用的特性，其本质是一个光、热、声、电的能量转移过程[29]。由于其体现的是透射光与入射光强度的比值及弱吸收的情况，很小的吸收也能被微音器检测，所以光声光谱的灵敏度和选择性均较高。其基本测量原理是单色光源（如红外激光）通过光声池，使待测气体吸收光能量，随即后产生脉冲压力波（即声信号），光学微音器检测声压的微小变化，其声压信号的幅度与待测气体浓度成正比[29,30]。

传统的气相色谱、质谱及电子鼻检测方法只能间断采样，灵敏度较低，且需要长时间收集气体，易干扰微生物的生长过程，引起测量误差。而高灵敏度的光声光谱检测技术则消除了上述缺点，为生物组织微量气体研究提供了一种新的手段。作为一种更便宜、实时、高效的分析仪器，该技术除在化学药品、毒品、炸药及环境污染物气体检测方面得到普遍应用，在生物医学领域也有相关应用[30-33]。Inagaki等[34]使用真空紫外光束（300～130 nm）作为光源，检测到脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、溶菌酶（lysozyme）、烯（squalene）、酵母细胞、胸腺嘧啶（thymine）、酪氨酸（tyrosin）、腺嘌呤（adenine）、麦角甾醇（ergosterol）和多聚苷酸（polyadenylicacid）等生物分子的真空紫外光声光谱。Poulet等[35]用光声光谱技术研究了人血中血红蛋白和载氧血红蛋白的光声光谱，并对人血的氧化作用和沉降速率等问题进行了研究。Arslanov等[36]对绿脓杆菌中的氰化氢进行连续13 d的检测，发现其浓度变化与时间变化的相关性。周篪声等[37]利用自制双光束光声光谱检测装置测量了人体（如胃、子宫、肺等）癌变组织和正常组织的光声光谱，发现人体癌变组织均在630 nm 附近有吸收峰出现，而正常组织均无此峰。由此初步判断在630 nm处出现的吸收峰是反映癌变组织所特有分子结构的特征谱带，因而可用来作为诊断癌症的重要依据，同时也为激光治疗癌症提供了有价值的光学资料[38]。总之，光声光谱技术检测MVOCs用于微生物鉴定方面的研究属国内外首创，具有较大的研究空间和临床应用价值，但是，建立大型的标准图谱数据库，形成计算机自动化鉴定系统，后期仍需要大量的研究。

5 展 望

MVOCs种类较多、成分复杂，其检测技术也形式多样，且各有利弊。气相色谱法和质谱法是目前发展较为成熟的技术，相关报道较多并取得了一些研究成果。但其预处理较复杂，操作过程较繁琐，设备较昂贵，且只能用于检测已知样品，灵敏度、选择性及稳定性均受到一定限制。电子鼻法是一种传感器诊断方法，但只能对整体混合物的生物挥发性特征作出响应，很难对单独挥发性成分做出具体分析。同时受传感器灵敏度、模式识别等技术方面的影响，其临床应用受到了一定的阻碍。光声光谱技术光源强度大、波长可调，信噪比大，灵敏度高，样品无需进行复杂的前处理，保持了生物试样的自然状态，减少了其他方法难以避免的误差。此外，其构造简单，体积小，价格较低，且易于和其他仪器（如电子计算机）联用，实现自动化分析。然而，光声光谱技术仍处于发展阶段，如需用于感染性致病菌的鉴定和临床疾病的诊断，有待更深入的研究。总之，通过检测挥发性代谢产物进一步鉴定病原微生物的方法是可行的，但是，其在临床中的应用任重而道远。

[1]陈 娟,史 辉,王 琼,等.细菌挥发性代谢产物的类型、检测技术及应用[J].微生物学杂志,2015,35 （1）:89-94.

[2]胡惠平,潘迎捷,刘 源,等.应用气味指纹技术检测猪肉假单胞菌[J].食品科学,2009,30（18）:327-332.

[3]秦娟秀,李 敏.MALDI-TOF MS指纹图谱技术在病原微生物分型中的应用前景[J].中华检验医学杂志,2015,38（ 6）:367-369.

[4]张勇兵.气相色谱法在微生物检测中的应用[J].实用预防医学,2008,15（1）:291-293.

[5]Henis Y,Gould J R,Alexander M.Detection and identification of bacteria by gas chromatography[J].Appl Microbiol,1966,14（4）:513-524.

[6]Mitruka B M,Alexander M.Rapid and sensitive detection of bacteria by gas chromatography[J].Appl Microbiol,1968,16（4）:636-640.

[7]周 方,于玺华,古惠英,等.裂解气相色谱法鉴定细菌的初步研究[J].军事医学科学院院刊,1982（2）:239-247.

[8]康 琳,李 楠,高宏伟,等.质谱技术在微生物检测和鉴定中的应用[J].中国卫生检验杂志,2010,20 （10）:2613-2617.

[9]Dolch M E,Hornuss C,Klocke C,et al.Volatile compound profiling for the identification of Gram-negative bacteria by ion-molecule reaction-mass spectrometry[J].J Applied Microbiol,2012,113（5）:1097-1105.

[10]李绚梅，应可净.部分细菌和真菌特征挥发性有机物的研究[D].杭州:浙江大学,2012.

[11]Barbieri E,Gioacchini A M,Zambonelli A,et al.Determination of microbial volatile organic compounds from staphylococcus pasteuri against tuber borchii using solid-phase microextraction and gas chromatography/ion trap mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2005,19（22）:3411-3415.

[12]Matysik S,Herbarth O,Mueller A.Determination of volatile metabolites originating from mould growth on wall paper and synthetic media[J].J Microbiol Methods,2008,75（2）:182-187.

[13]Gouw J D,Warneke C.Measurements of volatile organ iccompounds in the earth's atmosphere u sing proton transfer reaction mass spectrometry[J].Mass Spectrom Rev,2007,26（2）:223-257.

[14]李增和,金亮君,邓高峰,等.PTR-MS与GC/MS在VOCs分析中的比较[J].低温与特气,2009,27（4）:35-38.

[15]Bunge M,Araghipour N,Mikoviny T,et al.On-Line monitoring of microbial volatile metabolites by proton transfer reaction-mass spectrometry[J].Appl Environ Microbiol,2008,74（7）:2179-2186.

[16]O’Hara M,Mayhew C A.A preliminary comparison of volatile organic compounds in the headspace of cultures of staphylococcus aureus grown in nutrient,dextrose and brain heart bovine broths measured using a proton transfer reaction mass spectrometer[J].J Breath Res,2009,3（2）:159-207.

[17]Thorn R M,Reynolds D M,Greenman J.Multivariate analysis of bacterial volatile compound profiles for discrimination between selected species and strains in vitro[J].J Microbiol Methods,2011,84（2）:258-264.

[18]季仁东,王晓燕.离子迁移谱在生物医学中的应用介绍[J].光谱实验室,2010,27（5）:1929-1932.

[19]Maddula S,Maddula S,Schmid A,et al.Detection of volatile metabolites of escherichia coli by multi capillary column coupled ion mobility spectrometry[J].Anal Bioanal Chem,2009,394（3）:791-800.

[20]Perl T,Jünger M,Vautz W,et al.Detection of characteristic metabolites of aspergillus fumigatus and candida species using ion mobility spectrometry-metabolic profiling by volatile organic compounds[J].Mycoses,2011,54（6）:828-837.

[21]Kunze N,Göpel J,Kuhns M,et al.Detection and validation of volatile metabolic patterns over different strains of two human pathogenic bacteria during their growth in a complex medium using multi-capillary column-ion mobility spectrometry（MCC-IMS）[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97（8）:3665-3676.

[22]王丹凤,王锡昌,刘 源,等.基于电子鼻的气味指纹技术在有害微生物检测中的应用[J].食品工业科技,2010,31（8）:373-376.

[23]Bruins M,Bos A,Petit P L,et al.Device-independent real-time identification of bacterial pathogens with a metal oxide-based olfactory sensor[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2009,28（7）:775-780.

[24]Parry A D,Chadwick P R,Simon D,et al.Leg ulcer odour detection identifies beta-haemolytic streptococcal infection[J].J Wound Care,1995,4（9）:404-406.

[25]Šetkus A,Kancleris Ž,Olekas A,et al.Qualitative andquantitative characterization of living bacteria by dynamicresponse parameters of gas sensor array[J].Sensor Actuat B-Chem,2008,130（1）:351-358.

[26]邓高燕,喻勇新,潘迎捷,等.电子鼻对两种食源性致病菌在菌株水平上的研究[J].食品工业科技,2011,32（12）:142-148.

[27]陈 雪,倪 鹏,喻勇新,等.李斯特属细菌特征挥发性代谢物的鉴定分析[J].食品科学,2013,34（10）:231-237.

[28]Oh E H,Song H S,Park T H,et al.Recent advances in electronic and bioelectronic noses and their biomedical applications[J].Enzyme Microb Technol,2011,48（6-7）:427-437.

[29]王维江,朱延彬.光声光谱技术在生物医学领域的发展与应用[J].激光生物学报,1997,6（1）:1024-1029.

[30]Khalid T Y,Saliha S,John G,et al.Volatiles from oral anaerobes confounding breath biomarker discovery[J].J Breath Res,2013,7（1）:017114.

[31]Goeminne P C,Vandendriessche T,Eldere J V,et al.Detection of pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis[J].Respir Res,2012,13（1）:1-9.

[32]贾潇潇,李 晶,秦 天,等.表面增强拉曼光谱技术在微生物鉴定中的应用进展[J].生物工程学报,2015,31（5）:611-620.

[33]于清旭,李少成,梁秀萍,等.高灵敏度光声光谱仪及其生物学应用研究[J].激光技术,2011,25（1）:15-21.

[34]Inagaki T,Ito A,Hieda K,et al.Photoacoustic spectra of some biological molecules between 300 and 130 nm[J].Photochem Photobiol,1986,44（3）:303-306.

[35]潘志方,邓 献.光谱诊断技术在现代医学中的应用[J].大学物理实验,2007,20（3）:47-51.

[36]Arslanov D D,Castro M P,Creemers N A,et al.Optical parametric oscillator-based hotoacoustic detection of hydrogen cyanide for biomedical applications[J].J Biomed Opt,2013,18（10）:153-158.

[37]周篪声,郭周义,吴宏岳.癌变组织的光声光谱研究[J].光谱学与光谱分析,1995,15（4）:35-38.

[38]唐志列,夏云飞,李满枝,等.用光声光谱技术测量鼻咽癌细胞的光谱吸收特性[J].生物物理学报,2001,17 （2）:241-244.

（2016-01-15收稿 2016-03-03修回）

（责任编辑 付 辉）

Research progress on detection and clinical application of microbial volatile organic compounds

ZHANG Ye,GAO Hongmei,CHEN Wenli,TAN Qinghai,and ZHANG Jianpeng.Department of Internal Respiratory,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039,China

ZHANG Jianpeng,E-mail:zjp99vip@sina.com

Infectious disease is one of the serious diseases threating human health.At present,the aberration rate of infectious microorganism turns to be higher,species of microorganism are becoming diversified,and appears more frequently,these grim facts put forward greater challenges on identification of pathogenic microorganisms.Thus,it is of critical meaningful for early clinical treatment and prognosis of infectious diseases by developing a real-time and efficient technology that could detect microbial volatile organic compounds,and quickly identify pathogenic microorganisms.The author reviewed literatures,briefly introduced several common methods of MVOCs detection and their basic principles at home and abroad,summarized their latest application progress in identification of pathogenic microorganisms,and prospected their future development trend.

microbial volatile organic compounds;detection technology;microbial identification

R56

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.04.011

张 晔，硕士研究生在读，

E-mail:zhangye422208@163.com

100039 北京，武警总医院呼吸内科

张健鹏，E-mail:zjp99vip@sina.com