复方中药对链球菌性肺炎小鼠肺组织炎性细胞因子的影响研究

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·论著·

复方中药对链球菌性肺炎小鼠肺组织炎性细胞因子的影响研究

【摘要】目的探讨复方中药对链球菌性肺炎小鼠肺组织炎性细胞因子白介素(IL)-6、IL-2、干扰素γ(INF-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-10表达水平的影响。方法2014年3—10月选取健康BALB/c小鼠36只，采用随机数字表法分为3组：正常组、链球菌性肺炎模型组(模型组)、复方中药治疗组(中药组)，每组12只。模型组、中药组小鼠分别破损鼻黏膜，滴入50 μl配好的肺炎链球菌标准菌株溶液；正常组小鼠破损鼻黏膜，滴入50 μl无菌0.9%氯化钠溶液。中药组小鼠给予7.5 g·kg(-1)·d(-1)复方中药灌胃，正常组和模型组小鼠给予等剂量双蒸水灌胃，均2次/d，连续给药7 d。给药第7天，取肺组织，观察病理学表现，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组小鼠肺组织IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表达水平。结果苏木素-伊红(HE)染色光镜下显示，正常组肺泡结构及上皮完整，肺泡腔清晰，肺泡内无渗出物，肺泡间隔均匀一致，无增厚，毛细血管无明显扩张、充血及炎性细胞浸润；模型组肺泡腔内充满渗出的纤维素，出现大量炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚及毛细血管扩张、充血；中药组肺泡腔内纤维素渗出较少，肺间质有少量炎性细胞浸润，少量红细胞，部分肺泡破坏融合，与模型组比较有所减轻。模型组小鼠肺组织IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表达水平较正常组升高(P<0.05)；中药组小鼠肺组织IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表达水平较模型组降低(P<0.05)；中药组小鼠肺组织IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表达水平与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论复方中药能有效抑制链球菌性肺炎小鼠肺组织IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10的过度表达，缓解炎性反应。

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【关键词】肺炎球菌感染；复方合剂；小鼠；白介素类；干扰素γ；肿瘤坏死因子α

张丽娜，丛培玮，李乡南.复方中药对链球菌性肺炎小鼠肺组织炎性细胞因子的影响研究[J].中国全科医学，2016，19(12)：1467-1471.[www.chinagp.net]

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肺炎链球菌是5岁以下儿童社区获得性肺炎最常见的致病菌，30%～50%的小儿细菌性肺炎由肺炎链球菌所致[1]。肺炎链球菌耐药情况比较严重，特别是对阿奇霉素、红霉素、氯林可霉素、四环素及复方磺胺甲噁唑片等耐药率较高，部分可高达95%以上[2-4]，如此高的耐药率，可能与抗菌药物的滥用有关，故大环内酯类、四环素类以及复方新诺明等抗菌药物已不能作为治疗链球菌性肺炎的有效药物。中医药在防治链球菌性肺炎中起着积极的作用。本研究拟建立链球菌性肺炎小鼠模型，观察复方中药对链球菌性肺炎小鼠肺组织炎性细胞因子白介素(IL)-6、IL-2、干扰素γ(INF-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及IL-10表达水平的影响，为复方中药在链球菌性肺炎的临床治疗提供实验依据。

1材料与方法

1.1动物2014年3—10月选取健康BALB/c小鼠36只，SPF级，雌雄各半，5～6周龄，体质量18～20 g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。

1.2菌株肺炎链球菌标准菌株(CMCC 31203)购于中国医学细菌保藏管理中心，经血平板培养18 h后用无菌0.9%氯化钠溶液稀释至6×108CFU/ml(2麦氏单位)待用。

1.3药物复方中药组成：金银花30 g、连翘30 g、玄参15 g、牛蒡子30 g、板兰根15 g、黄芩30 g(购于辽宁中医药大学附属医院)，以上6味药加水浸泡1 h，然后煎煮3次，30 min/次，过滤合并滤液，浓缩至1 g/ml生药量，置4 ℃冰箱保存，给药前复温25～30 ℃。

1.4试剂乌来糖(购于国药集团化学试剂有限公司，药品批号：20050922)，小鼠IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测试剂盒(购于苏州卡尔文生物科技有限公司)。

1.5仪器酶标仪(Anthos 2010，奥地利安图公司)，全自动酶标洗板机(Anthos fluido，奥地利安图公司)，离心机(TGL-16G，上海医用分析仪器厂)，电动匀浆机(FSH-2，江苏省金坛市环宇科学仪器厂)，移液器(TriptteTM)，电热恒温箱(HH.B11.600，上海博迅医疗器械厂)，电子天平(JY5002，上海精密科学仪器有限公司)，显微镜(Olympus CX21，日本奥林巴斯公司)，石蜡切片机(徕卡2135，德国Leica公司)。

1.6实验分组将36只BALB/c小鼠采用随机数字表法(先雌雄分组，再按照随机数字表法分组)分为3组：正常组、链球菌性肺炎模型组(模型组)、复方中药治疗组(中药组)，每组12只，雌雄各半。3组小鼠周龄、体质量比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1　3组小鼠周龄、体质量比较±s)

1.7链球菌性肺炎模型建立[5]每组小鼠称重后，后腿肌肉注射10%乌来糖800 mg/kg进行麻醉后，模型组、中药组小鼠分别破损鼻黏膜，滴入50 μl配好的肺炎链球菌标准菌株溶液(菌量3×107CFU)；正常组小鼠破损鼻黏膜，滴入50 μl无菌0.9%氯化钠溶液。滴入同时注意观察小鼠的呼吸情况，若出现窒息立即给予牵拉前肢、挤压心脏处理。

1.8给药每组给药剂量根据小鼠体质量按成人日剂量折算出等效剂量为2.5 g·kg-1·d-1。肺炎链球菌感染后1 h，中药组小鼠按等效剂量的3倍给予7.5 g·kg-1·d-1复方中药灌胃，2次/d，连续给药7 d；正常组和模型组小鼠给予等剂量双蒸水灌胃，2次/d，连续给药7 d。

1.9观察指标检测给药第7天，每组采用随机数字表法抽取10只小鼠，后腿肌肉注射10%乌来糖800 mg/kg麻醉后，固定于解剖板。75%乙醇消毒后，剖开胸腔，取出左肺，立即放入10%甲醛溶液中固定72 h，梯度乙醇溶液脱水后常规石蜡包埋，切片(厚度5 μm)，苏木素-伊红(HE)染色后镜下观察肺组织病理变化。取出右肺并称重，加入9倍肺组织重的0.9%氯化钠溶液，用电动匀浆机匀浆，将肺匀浆于4 ℃下，12 000 r/min离心15 min(离心半径6 cm)，收集上清液，储存于-70 ℃冰箱，然后按照ELISA法测检试剂盒说明书检测肺组织炎性细胞因子IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α及IL-10表达水平。

2结果

2.1大体观察正常组：双肺呈均匀粉白色，表面光滑，组织有弹性，未见明显水肿及出血点。模型组：双肺出现广泛大片状的充血，肺组织外观肿胀，暗红色与淡黄色交织，弹性差。中药组：双肺可见小片状的充血，弹性较差，色暗红，与模型组小鼠比较，病变程度明显减轻，肺脏暗褐色区域减少，肺组织充血、水肿减轻，实变区减少。

2.2HE染色光镜观察正常组：肺泡结构及上皮完整，肺泡腔清晰，肺泡内无渗出物，肺泡间隔均匀一致，无增厚，毛细血管无明显扩张、充血及炎性细胞浸润(见图1，本文图1～3彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。模型组：肺泡腔内充满渗出的纤维素，出现大量炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚及毛细血管扩张、充血(见图2)。中药组：肺泡腔内纤维素渗出较少，肺间质有少量炎性细胞浸润，少量红细胞，部分肺泡破坏融合，与模型组比较有所减轻(见图3)。

图1　正常组小鼠肺组织切片(HE染色，×200)

图2　模型组小鼠肺组织切片(HE染色，×200)

图3　中药组小鼠肺组织切片(HE染色，×200)

2.3肺组织炎性细胞因子表达水平比较3组小鼠肺组织IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组小鼠肺组织IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表达水平较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；中药组小鼠肺组织IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表达水平较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；中药组小鼠肺组织IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表达水平与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

3讨论

肺炎链球菌感染后机体免疫稳态被破坏，免疫抑制和免疫调节功能下降，若感染控制不当可引起机体病理损伤甚至宿主死亡[6]。本研究肺组织切片显示，链球菌性肺炎小鼠肺泡腔内充满渗出的纤维素，出现大量炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚及毛细血管扩张、充血等一系列病理损伤；而复方中药能有效改善小鼠肺泡腔内炎性渗出及黏膜损伤。刘琪等[7]研究表明，中药(金银花、连翘、牛蒡子等)能改善流感病毒感染小鼠肺组织引起的病理损伤。

研究显示，IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10等炎性细胞因子表达水平与链球菌性肺炎具有相关性[8-10]。在巨噬细胞释放的炎性细胞因子中，IL-6、TNF-α等为早期主要的促炎性细胞因子[11]，促炎性细胞因子水平升高同时伴随抗炎性细胞因子IL-10水平升高，IL-10具有很强的抗炎能力和免疫抑制活性，可下调多种促炎性细胞因子如TNF-α和INF-γ的表达，在多种疾病中发挥重要作用[12]。姜小丽等[8]研究发现，小鼠在感染肺炎链球菌后肺组织中INF-γ、TNF-α、IL-6、IL-10表达水平明显升高，肺组织结构恢复后抗炎性细胞因子IL-10表达水平才下降，提示IL-10在抑制肺炎链球菌感染所致的过强炎性反应中有重要作用。本研究结果显示，小鼠感染肺炎链球菌后，肺组织中各炎性细胞因子表达水平明显升高，与姜小丽等[8]研究IL-6、INF-γ、TNF-α、IL-10表达水平升高结果一致。可见，炎性细胞因子承接固有免疫与适应性免疫应答反应，促炎性细胞因子及抗炎性细胞因子均在清除肺炎链球菌中发挥重要作用，维持其动态平衡既能清除细菌也能避免过度炎性反应所致的组织损伤[8]。IL-2是由活化的T细胞产生的具有广泛生物活性的炎性细胞因子，参与炎症或自身免疫性反应，而且具有双向免疫调节作用，是最受关注和被广泛研究的细胞因子之一[13]。李继庭等[14]研究表明，流感病毒感染小鼠血清中IL-2表达水平升高；王巍[10]研究表明，支原体肺炎大鼠肺组织IL-2表达水平降低；Koh等[15]研究发现，肺炎链球菌感染者支气管肺泡灌洗液IL-2表达水平升高；刘贺临等[16]研究表明，支原体肺炎患儿血清IL-2表达水平降低。本研究结果显示，小鼠感染肺炎链球菌后肺组织IL-2表达水平升高，其机制可能是T细胞受刺激后产生IL-2，产生的IL-2又反作用于T细胞自身，诱导T细胞自身增殖、分化和发挥免疫功能[14]，与其他研究中不同动物、组织及病原感染情况下研究结果各异[10,15-16]，其机制还有待进一步研究。

表2　3组小鼠肺组织炎性细胞因子表达水平比较±s，pg/ml)

注：IL-6=白介素6，IL-2=白介素2，INF-γ=干扰素γ，TNF-α=肿瘤坏死因子α，IL-10=白介素10；与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

本研究复方中药为临床经验方，具有清热解毒，化瘀通络的功效。现代药理学研究表明，金银花、连翘、黄芩、板蓝根对肺炎链球菌具有较强的抑制作用[17-18]，玄参具有解热、镇痛、抗炎等作用[19]，牛蒡子具有抗炎、抗病毒、抗菌等作用[20]。金银花能够抑制人类肺脏细胞产生TNF-α[21]。板蓝根多糖可显著抑制内毒素诱导单核细胞分泌IL-6的活性[22]。黄芩苷体内给药一般可以减轻组织炎性损伤，下调模型动物血浆促炎细胞因子表达水平(TNF-α、IL-6等)，并可以调节部分免疫细胞分泌细胞因子[23]。本研究肺组织切片提示，中药组炎性反应较模型组明显减轻，表明复方中药对肺炎链球菌所致肺部炎性损伤有改善作用；炎性细胞因子比较结果显示，中药组炎性细胞因子IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表达水平较模型组明显降低，表明复方中药对以上炎性细胞因子具有调节作用，能有效抑制其过度分泌，缓解炎性反应。

同时，本研究存在不足之处。首先，本研究未能揭示出复方中药的最佳剂量及最佳用药时机；其次，本研究实验时间较短，样本量偏小，今后若能开展针对疗效机制、大样本、不同剂量的基础研究可望得到更有说服力的结果。

综上所述，本实验证实，复方中药对链球菌性肺炎小鼠炎性细胞因子具有拮抗作用。在链球菌性肺炎耐药率升高的情况下，此研究为中医药防治链球菌性肺炎提供了实验数据，具有良好的临床开发前景，但其具体调节及作用机制还有待进一步研究。

作者贡献：张丽娜、丛培玮进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；丛培玮、李乡南进行实验实施、评估、资料收集；丛培玮进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Effects of Complex Prescription of Traditional Chinese Medicine on Inflammatory Cytokines in Lung Tissue of Streptococcus Pneumonia Mice

ZHANGLi-na,CONGPei-wei,LIXiang-nan.CentreforExperimentalTeaching，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of complex prescription of traditional Chinese medicine on expression levels of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α,and IL-10 in lung tissue of streptococcus pneumonia mice.MethodsFrom March to October in 2014,we selected 36 healthy BALB/c mice and used random number table method to divide them into 3 groups,namely control group,streptococcus pneumonia model group(model group),and the group of complex prescription of TCM (TCM group),with 12 mice in each group.The mice in the model group and TCM group were given 50 μl standard solution of streptococcus pneumoniae through damaged nasal mucosa,and the mice in control group were given the same mount of 0.9% sodium chloride liquid.Mice in TCM group was given complex prescription of TCM by gavage by 7.5 g·kg(-1)·d(-1),and control group and model group were given the same amount of double distilled water by 2 times per day for 7 days consecutively.Lung tissues were taken in the 7 dany to observe pathological manifestations,and ELISA method was used to detect the expression levels of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α and IL-10 in lung tissue.ResultsAfter the observation by HE staining and light microscope,we found the following results.In control group,the alveolar structure and epithelium were complete with clear alveolar space and no transudation;the alveolar space was homogeneous without incrassation;no obvious expansion,congestion and inflammatory cell infiltration occurred in inner capillaries.In model group,alveolar space was full of cellulose exudate;plenty of inflammatory cell infiltration occurred;alveolar space had incrassation;expansion and congestion occurred in capillaries.In TCM group,there was little cellulose exudate in alveolar space,little inflammatory cell infiltration in pulmonary mesenchyme and a small number of red blood cells;a part of pulmonary alveolis were damaged and merged;the condition was much relieved compared with model group.Model group was higher than control group in the expression levels of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α and IL-10 in lung tissue(P<0.05).TCM group was lower than model group in the expression levels of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α and IL-10 in lung tissue(P<0.05);TCM group was not significantly different from control group in the expression levels of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α and IL-10 in lung tissue(P>0.05).ConclusionComplex prescription of TCM can effectively inhibit the excessive secretion of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α,and IL-10 in lung tissue of streptococcus pneumonia mice,and relieve inflammatory reaction.

【Key words】Pneumococcal infections；Drug combinations；Mice；Interleukins；Interferon-gamma；Tumor necrosis factor-alpha

(收稿日期：2015-07-24；修回日期：2016-02-16)

【中图分类号】R 563.1

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.022

通信作者:丛培玮，110847辽宁省沈阳市，辽宁中医药大学教学实验中心；E-mail:cpwshq2011@163.com

基金项目:辽宁省科学技术厅博士科研启动基金项目(20131069)

·中医·中西医结合研究·

张丽娜，丛培玮，李乡南