微小RNA-150对鼻咽癌细胞放疗抵抗的影响研究

张先锋，黄远见，肖 娟，张志伟，黄卫国

421001 湖南省衡阳市，南华大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科(张先锋，黄远见，肖娟，张志伟，黄卫国)；南华大学肿瘤研究所(张志伟，黄卫国)



·论著·

微小RNA-150对鼻咽癌细胞放疗抵抗的影响研究

张先锋，黄远见，肖 娟，张志伟，黄卫国

421001 湖南省衡阳市，南华大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科(张先锋，黄远见，肖娟，张志伟，黄卫国)；南华大学肿瘤研究所(张志伟，黄卫国)

【摘要】目的探讨微小RNA(miR)-150对于鼻咽癌细胞放疗抵抗的影响，并分析其机制。方法2014年1月—2015年6月，建立放疗抵抗的鼻咽癌细胞株CNE-2R。取CNE-2和CNE-2R，通过克隆形成实验计算不同放疗剂量下(0、3、6 Gy)的克隆形成率(PE)、细胞存活率，采用MTS法检测照射1、2、3、4、5 d时的细胞增殖活性，实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测miR-150、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)mRNA水平，Western blotting法检测GSK3β水平。将CNE-2随机分为miR-150模拟物组(转染miR-150模拟物)、微小RNAs(miRs)无关序列组(转染miRs无关序列)，通过荧光素酶报告载体实验检测荧光素酶活性。结果0 Gy放疗剂量时，CNE-2与CNE-2R的PE、细胞存活率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；3 Gy、6 Gy放疗剂量时，CNE-2R的PE、细胞存活率高于CNE-2(P<0.05)。照射1～5 d时，CNE-2R的细胞增殖活性高于CNE-2(P<0.05)。CNE-2R中miR-150水平高于CNE-2，GSK3β mRNA水平低于CNE-2(P<0.05)。CNE-2R中GSK3β水平低于CNE-2(P<0.05)。转染GSK3β野生型质粒后，miR-150模拟物组荧光素酶活性低于miRs无关序列组(P<0.05)；转染GSK3β突变型质粒后，miRs无关序列组与miR-150模拟物组荧光素酶活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-150参与了鼻咽癌细胞的放疗抵抗，GSK3β是miR-150的直接靶基因，miR-150-GSK3β轴可能成为一种新的用于合理治疗鼻咽癌的策略。

【关键词】鼻咽肿瘤；放射疗法；微小RNA-150；糖原合成酶激酶类

张先锋，黄远见，肖娟，等.微小RNA-150对鼻咽癌细胞放疗抵抗的影响研究[J].中国全科医学，2016，19(12)：1424-1428.[www.chinagp.net]

Zhang XF,Huang YJ,Xiao J,et al.Influence of miR-150 on the radioresistance of nasopharyngeal carcinoma cells[J].Chinese General Practice，2016，19(12)：1424-1428.

鼻咽癌是一种具有较强局部侵袭力以及早期转移特点的恶性肿瘤，由于其解剖位置特殊且对放射线较为敏感，放疗是其最重要的治疗方法。然而，放疗抵抗仍然是鼻咽癌治疗中的一大难题[1-3]。微小RNAs(miRs)是一类内源性的短的保守的非编码RNA，其通过与mRNA的3′端非翻译区(3′UTR)特异结合使之降解或者抑制其翻译，从而调控相关靶基因的表达[4-5]。miRs在许多人类癌症中发挥着原癌基因或肿瘤抑制基因的作用[6]。一些miRs已被证实与鼻咽癌的发生、发展、侵袭和转移密切相关，如微小RNA(miR)-141、miR-218、miR-26a[7-9]。然而，miRs在鼻咽癌细胞放疗抵抗中所发挥的作用至今鲜有报道。本研究探讨miR-150对于鼻咽癌细胞放疗抵抗的影响，并分析其机制，以期为合理制定鼻咽癌治疗策略提供科学依据。

1材料与方法

1.1细胞来源鼻咽癌细胞株CNE-2为低分化细胞株，购置于上海细胞研究所，由南华大学肿瘤研究所保存。

1.2主要材料miR-150模拟物及miRs无关序列购自Ambion公司；野生型质粒与突变型质粒由广州复能基因有限公司构建；糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抗体购自Santa Cruz Biotechnology；β-actin抗体购自CST公司；山羊抗小鼠(HRP)二抗购自Thermo公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen生命技术公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；CellTiter 96®AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒购自Promega公司；ELx800酶标仪购自美国BioTek公司；miRNA提取试剂盒购自OMEGA Bio-Tek公司；miScript Ⅱ RT Kit、SYBR Green PCR试剂盒购自QIAGEN。

1.3研究方法

1.3.1建立放疗抵抗的鼻咽癌细胞株CNE-2R与细胞培养2014年1月—2015年6月，建立放疗抵抗的鼻咽癌细胞株CNE-2R：取对数生长期的鼻咽癌细胞株CNE-2，予以依次递增的放疗剂量(1、2、4、6、8 Gy)照射，每个剂量至少照射3次，直到细胞增殖到80%再进行下一个剂量的照射，该阶段共12个月。CNE-2和CNE-2R培养于含10%新生胎牛血清的RPMI1640培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下传代培养，每1～2 d更换1次培养基，取生长良好的CNE-2及CNE-2R用于本实验。

本研究创新点：

鼻咽癌是发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，由于其发生部位的特殊性，放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法。鼻咽癌的治疗失败常与放疗抵抗相关。微小RNAs(miRs)是一类内源性的非编码RNA，一些miRs已被证实与鼻咽癌的发生、发展密切相关，然而，miRs在鼻咽癌放疗抵抗中所发挥的作用至今鲜有报道。本文通过比较放疗抵抗的鼻咽癌细胞株CNE-2R与鼻咽癌细胞株CNE-2，发现CNE-2R中微小RNA(miR)-150表达上调，糖原合成酶激酶3β(GSK3β)表达下调，GSK3β是miR-150的靶基因，提示miR-150可通过靶向抑制GSK3β的表达来调控鼻咽癌细胞的放疗抵抗。本研究丰富了人们对miRs在鼻咽癌放疗抵抗中作用的认识，为预测鼻咽癌细胞放疗抵抗提供了线索，具有一定的创新性和价值。

1.3.2克隆形成实验用0.125%的胰蛋白酶消化对数生长期的CNE-2和CNE-2R，制成单细胞悬液，以2 000个/孔接种于6孔板中，隔夜待细胞贴壁后，分别用0、3、6 Gy放疗剂量满射野照射，继续培养15 d，弃去培养液，0.9%氯化钠溶液洗涤2次，10%甲醇溶液固定15 min，然后去除固定液，使用0.06%结晶紫试剂染色。用显微镜观察，计数细胞团数(>50个细胞，克隆数)，计算克隆形成率(PE)〔PE=克隆数/接种细胞数×100%〕。以0 Gy放疗剂量的克隆形成率为对照，计算细胞存活率(细胞存活率=观察组PE/对照组PE×100%)。实验独立重复3次，取均值。

1.3.3MTS法检测细胞增殖活性采用MTS法检测细胞增殖活性，按照CellTiter 96®AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒说明书进行操作。收集生长良好的CNE-2和CNE-2R，分别制成单细胞悬液后，以2 000个/孔(0.20 ml/孔)接种到96孔板中，以3 Gy放疗剂量进行照射。分别在1、2、3、4、5 d时加入MTS(0.02ml/孔)，孵育2 h后，用ELx800酶标仪测定每孔在490 nm处的吸光度(OD值)，根据OD值判定细胞增殖活性。实验独立重复3次，取均值。

1.3.4实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测miR-150、GSK3β mRNA水平取适量CNE-2及CNE-2R，采用miRNA提取试剂盒提取纯化miRs，利用miScript Ⅱ RT Kit反转录合成cDNA。按照SYBR Green PCR试剂盒说明书进行Real-time PCR操作。miR-150正向引物：5′-UAUACAAAACAAGCUGUC

UGUTT-3′，反向引物：5′-ACAGCCGCUUGCCCGUUG

UCGCTT-3′；U6正向引物：5′-UUCUCCGAACGUGU

CACGUTT-3′，反向引物：5′-ACGUGACACGUUCGG

AGAATT-3′；GSK3β正向引物：5′-GACTAAGGTCTTCCGACCCC-3′，反向引物：5′-TTAGCATCTGACGCTGCTGT-3′；GAPDH正向引物：5′-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3′，反向引物：5′-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3。在Real-time PCR仪内进行PCR扩增，反应体系为20 μl：包括稀释后的RT产物2 μl、2×qRT-PCR缓冲液10 μl、5 μmol/L特异性PCR引物0.4 μl、5 U/μl耐热DNA聚合酶0.2 μl、灭菌双蒸水7.4 μl。反应条件：95 ℃ 3 min活化Taq酶，95 ℃ 12 s、62 ℃ 35 s，共40个循环；熔解曲线检测从62 ℃开始至95 ℃停止。检测miR-150水平时，以U6作为内参；检测GSK3β mRNA水平时，以GAPDH作为内参。实验独立重复3次，取均值。

1.3.5Western blotting法检测GSK3β水平收集CNE-2及CNE-2R，加入RIPA细胞裂解液以及蛋白酶抑制剂，提取细胞总蛋白，采用BCA法对蛋白水平进行测定。分别取等量CNE-2、CNE-2R蛋白，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在含5%脱脂牛奶的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液中封闭，加入β-actin抗体以及GSK3β抗体，4 ℃过夜，洗膜，加入HRP二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜30 min，然后加入发光剂，X片曝光、显影、定影。

1.3.6细胞转染用胰蛋白酶对CNE-2及CNE-2R进行消化，将细胞计数并接种在96孔板中。CNE-2及CNE-2R分别随机分为miR-150模拟物组(转染miR-150模拟物)、miRs无关序列组(转染miRs无关序列)，两组再分别转染GSK3β野生型质粒、GSK3β突变型质粒。使用Lipofectamine 2000转染试剂将浓度均为100 nmol/L的miR-150模拟物、GSK3β野生型质粒、GSK3β突变型质粒以及miRs无关序列转染至细胞。在转染36 h后，进行后续实验。

1.3.7荧光素酶报告载体实验检测荧光素酶活性根据GSK3β 3′UTR序列与miR-150结合位点设计合成野生型引物以及突变型引物，正、反向引物分别引入限制性内切酶SpeⅠ和HindⅢ识别位点。当相应的正、反义链扩增退火完成后，将其连接到含有荧光素酶报告基因的载体质粒上。细胞转染后，收集CNE-2，将含有荧光素酶报告基因的载体质粒转染至细胞中。使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。实验独立重复3次，取均值。

2结果

2.1克隆形成实验结果0Gy放疗剂量时，CNE-2与CNE-2R的PE、细胞存活率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；3Gy、6Gy放疗剂量时，CNE-2R的PE、细胞存活率高于CNE-2，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2细胞增殖活性比较照射1～5d时，CNE-2R的细胞增殖活性高于CNE-2，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3miR-150、GSK3βmRNA水平比较CNE-2R中miR-150水平高于CNE-2，GSK3βmRNA水平低于CNE-2，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

2.4GSK3β水平比较CNE-2R中GSK3β水平为(0.58±0.04)，低于CNE-2的(1.12±0.13)，差异有统计学意义(t=11.65，P<0.001)。

2.5荧光素酶活性比较转染GSK3β野生型质粒后，miR-150模拟物组荧光素酶活性低于miRs无关序列组，差异有统计学意义(P<0.05)；转染GSK3β突变型质粒后，miRs无关序列组与miR-150模拟物组荧光素酶活性比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表4)。

表1　CNE-2与CNE-2R的PE及细胞存活率比较

注：PE=克隆形成率

表2　CNE-2与CNE-2R的细胞增殖活性比较

表3CNE-2与CNE-2R中miR-150、GSK3β mRNA水平比较

Table 3Comparison of the levels of miR-150 and GSK3β mRNA between CNE-2 and CNE-2R cells

细胞株miR-150GSK3βmRNACNE-20.99±0.041.00±0.07CNE-2R2.02±0.200.57±0.08t值8.176.53P值0.0010.002

注：miR-150=微小RNA-150，GSK3β=糖原合成酶激酶3β

Table 4Comparison of the luciferase activity of CNE-2 cells between miRs irrelevant sequence group and miR-150 mimics group

组别GSK3β野生型质粒GSK3β突变型质粒miRs无关序列组1.04±0.071.01±0.02miR-150模拟物组0.50±0.040.99±0.04t值11.991.37P值<0.0010.324

3讨论

肿瘤的化疗抵抗和放疗抵抗是癌症临床治疗中的主要障碍。尽管已经建立了一些肿瘤化疗或放疗抵抗的细胞模型，如耐平阳霉素的舌癌Tca8113细胞株[10]、耐氟尿嘧啶的乳腺癌MCF-7细胞株[11]以及耐放疗胶质瘤MGR2细胞株[12]，并且进行了大量的机制研究，但仍然存在许多尚待进一步探讨的问题。近年来，越来越多的研究表明，miRs的异常表达在肿瘤的发生、发展以及放/化疗抵抗中起重要作用，可作为癌症重要的潜在的预后指标或治疗靶点，如miR-200b的表达水平在耐多西他赛的非小细胞肺癌细胞中显著下降[13]，其亦可通过调节膀胱癌细胞的上皮-间质转化(EMT)过程从而逆转膀胱癌细胞对表皮生长因子受体的治疗抵抗[14]。且近期研究发现，通过在顺铂耐药舌癌细胞中重新过表达miR-200b和miR-15b，能够减少组蛋白表达水平，使该细胞对化疗重新敏感[15]。放疗抵抗是鼻咽癌治疗成功与否的关键，然而关于miRs在鼻咽癌细胞放疗抵抗中的作用仍不清楚。

为了探究鼻咽癌细胞放疗抵抗机制，本研究建立了放疗抵抗的鼻咽癌细胞株CNE-2R，结果显示，3 Gy、6 Gy放疗剂量时，CNE-2R的PE、细胞存活率高于CNE-2；照射1～5 d时，CNE-2R的细胞增殖活性高于CNE-2。提示放疗抵抗的鼻咽癌细胞株CNE-2R可以耐放疗且可促进细胞的增殖。已有文献报道，miR-150促进一些肿瘤的发生发展，其通过靶向胃癌组织中早期生长反应蛋白2发挥促癌作用[16]，在恶性肿瘤中可靶向促凋亡的嘌呤能P2X7受体发挥癌基因作用[17]。Ma等[18]研究发现，抑制GSK3β活性与EZH2过表达和肿瘤的侵袭性增加有关。研究表明，GSK3β活性对鼻咽癌生物学特性有明显的调节作用，然而其在鼻咽癌组织中的表达仍不清楚[18]。miRs是通过调控其下游的靶基因发挥作用的，为探讨miR-150和GSK3β在放疗抵抗的鼻咽癌细胞株CNE-2R的表达改变和作用，本研究进一步检测发现，CNE-2R中miR-150水平高于CNE-2，GSK3β mRNA及其蛋白水平低于CNE-2；转染GSK3β野生型质粒后，miR-150模拟物组荧光素酶活性低于miRs无关序列组，说明GSK3β是miR-150的靶基因，提示miR-150可通过靶向抑制GSK3β的表达来调控鼻咽癌细胞的放疗抵抗。

本研究存在一定的局限性：(1)本研究仅比较了CNE-2与CNE-2R两种细胞株之间的miR-150表达差异，并未涉及更多的鼻咽癌放疗抵抗的细胞系；(2)未检测人鼻咽癌组织标本中miR-150的表达。在之后的研究中，将进一步探讨GSK3β对鼻咽癌细胞放疗抵抗调节的详细机制。

总之，miR-150参与了鼻咽癌细胞的放疗抵抗，GSK3β是miR-150的直接靶基因，miR-150-GSK3β轴可能成为一种新的用于合理治疗鼻咽癌的策略。

作者贡献：张先锋、黄远见、肖娟、张志伟、黄卫国进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；张先锋、黄远见、肖娟进行实验实施、评估、资料收集；张志伟进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

参考文献

[1]DeNittis AS,Liu L,Rosenthal DI,et al.Nasopharyngeal carcinoma treated with external radiotherapy,brachytherapy,and concurrent/adjuvant chemotherapy[J].Am J Clin Oncol,2002,25(1):93-95.

[2]Chang JT,Ko JY,Hong RL.Recent advances in the treatment of nasopharyngeal carcinoma[J].J Formos Med Assoc,2004,103(7):496-510.

[3]Gupta AK,McKenna WG,Weber CN,et al.Local recurrence in head and neck cancer:relationship to radiation resistance and signal transduction[J].Clin Cancer Res,2002,8(3):885-892.

[4]Tang H,Kong Y,Guo J,et al.Diallyl disulfide suppresses proliferation and induces apoptosis in human gastric cancer through Wnt-1 signaling pathway by up-regulation of miR-200b and miR-22[J].Cancer Lett,2013,340(1):72-81.

[5]Davis-Dusenbery BN,Hata A.MicroRNA in cancer:the involvement of aberrant MicroRNA biogenesis regulatory pathways[J].Genes Cancer,2010,1(11):1100-1114.

[6]Tang H,Deng M,Tang Y,et al.miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression[J].Clin Cancer Res,2013,19(20):5602-5612.

[7]Zhang L,Deng T,Li X,et al.microRNA-141 is involved in a nasopharyngeal carcinoma-related genes network[J].Carcinogenesis,2010,31(4):559-566.

[8]Alajez NM,Lenarduzzi M,Ito E,et al.MiR-218 suppresses nasopharyngeal cancer progression through downregulation of survivin and the SLIT2-ROBO1 pathway[J].Cancer Res,2011,71(6):2381-2391.

[9]Lu J,He ML,Wang L,et al.MiR-26a inhibits cell growth and tumorigenesis of nasopharyngeal carcinoma through repression of EZH2[J].Cancer Res,2011,71(1):225-233.

[10]Zheng G,Zhou M,Ou X,et al.Identification of carbonic anhydrase 9 as a contributor to pingyangmycin-induced drug resistance in human tongue cancer cells[J].FEBS J,2010,277(21):4506-4518.

[11]Zheng G,Peng F,Ding R,et al.Identification of proteins responsible for the multiple drug resistance in 5-fluorouracil-induced breast cancer cell using proteomics analysis[J].J Cancer Res Clin Oncol,2010,136(10):1477-1488.

[12]Cheng JJ,Hu Z,Xia YF,et al.Radioresistant subline of human glioma cell line MGR2R induced by repeated high dose X-ray irradiation[J].Ai Zheng,2006,25(1):45-50.

[13]Rui W,Bing F,Hai-Zhu S,et al.Identification of microRNA profiles in docetaxel-resistant human non-small cell lung carcinoma cells(SPC-A1)[J].J Cell Mol Med,2010,14(1/2):206-214.

[14]Adam L,Zhong M,Choi W,et al.miR-200 expression regulates epithelial-to-mesenchymal transition in bladder cancer cells and reverses resistance to epidermal growth factor receptor therapy[J].Clin Cancer Res,2009,15(16):5060-5072.

[15]Sun L,Yao Y,Liu B,et al.MiR-200b and miR-15b regulate chemotherapy-induced epithelial-mesenchymal transition in human tongue cancer cells by targeting BMI1[J].Oncogene,2012,31(4):432-445.

[16]Wu Q,Jin H,Yang Z,et al.miR-150promotes gastric cancer proliferation by negatively regulating the pro-apoptotic gene EGR2[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,392(3):340-345.

[17]Zhou L,Qi X,Potashkin JA,et al.MicroRNAs miR-186 and miR-150down-regulate expression of the pro-apoptotic purinergic P2X7 receptor by activation of instability sites at the 3′-untranslated region of the gene that decrease steady-state levels of the transcript[J].J Biol Chem,2008,283(42):28274-28286.

[18]Ma R,Wei Y,Huang X,et al.Inhibition of GSK3β activity is associated with excessive EZH2 expression and enhanced tumour invasion in nasopharyngeal carcinoma[J].PLoS One,2013,8(7):e68614.

(本文编辑：崔丽红)

Influence of miR-150 on the Radioresistance of Nasopharyngeal Carcinoma Cells

ZHANGXian-feng,HUANGYuan-jian,XIAOJuan,etal.DepartmentofOtorhinolaryngology,theSecondHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of miR-150 on the radioresistance of nasopharyngeal carcinoma(NPC) cells and analyze its mechanism.MethodsFrom January 2014 to June 2015,we established a radioresistant NPC cell line CNE-2R.CNE-2 and CNE-2R were taken,and clone formation assay was conducted to calculate cloning formation efficiency(PE) and cell survival rate with different radiotherapy doses(0,3 and 6 Gy).MTS method was employed to detect cell proliferation activity on day 1,day 2,day 3,day 4 and day 5.Real-time PCR method was used to detect the levels of miR-150 and GSK3β mRNA,and GSK3β level was measured by Western blotting method.CNE-2 cells were randomly divided into miR-150 mimics group(transfection of miR-150 mimics) and miRs irrelevant sequence group(transfection of miRs irrelevant sequence),and luciferase activity was detected by luciferasereport carrier experiment.ResultsCNE-2 and CNE-2R were not significantly different in PE and cell survival rate when the radiation dose was 0 Gy(P>0.05).CNE-2R was higher than CNE-2 in PE and cell survival rate when the radiation doses were 3 Gy and 6 Gy(P<0.05).After radiation for 1 day to 5 days,the activity of CNE-2R cell proliferation activity was higher than CNE-2(P<0.05).CNE-2R was higher in miR-150 and lower in GSK3β mRNA than CNE-2(P<0.05).CNE-2R was lower than CNE-2 in the level of GSK3β(P<0.05).After the transfection of GSK3β wild type plasmid,miR-150 mimics group was lower than miRs irrelevant sequence group in luciferase activity(P<0.05);after the transfection of GSK3β mutant plasmid,miRs irrelevant sequence group and miR-150 mimics group were not significantly different in luciferase activity(P>0.05).ConclusionmiR-150 is involved in the radioresistance of NPC cells.GSK3β is a direct target gene of miR-150,and miR-150-GSK3β axis may be a possible strategy for rational NPC treatment.

【Key words】Nasopharyngeal neoplasms;Radiotherapy;miR-150;Glycogen synthase kinases

(收稿日期：2015-08-28；修回日期：2016-02-29)

【中图分类号】R 766.3

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.014

通信作者：黄卫国，421001 湖南省衡阳市，南华大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科，南华大学肿瘤研究所；

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81172210)；湖南省省级科技计划项目(2014SK3081)

E-mail：nhdxzzw@qq.com