儿童注意缺陷多动障碍与5-羟色胺R2A基因多态性的相关性研究

梁友芳，农清清，覃健敏，韦宏旷，郭尧平，范 誉，班彩霞，李慕军

530021广西南宁市，广西医科大学第一附属医院(梁友芳，李慕军)；广西医科大学公共卫生学院(农清清，郭尧平，范誉)；南宁市疾病预防控制中心(覃健敏)；广西壮族自治区疾病预防控制中心(韦宏旷)；广西壮族自治区妇幼保健院(班彩霞)



·论著·

儿童注意缺陷多动障碍与5-羟色胺R2A基因多态性的相关性研究

梁友芳，农清清，覃健敏，韦宏旷，郭尧平，范 誉，班彩霞，李慕军

530021广西南宁市，广西医科大学第一附属医院(梁友芳，李慕军)；广西医科大学公共卫生学院(农清清，郭尧平，范誉)；南宁市疾病预防控制中心(覃健敏)；广西壮族自治区疾病预防控制中心(韦宏旷)；广西壮族自治区妇幼保健院(班彩霞)

【摘要】目的探讨5-羟色胺(5-HT)R2A基因单核苷酸多态性与儿童注意缺陷多动障碍(ADHD)的关系。方法于2011年12月—2013年1月广西儿童ADHD流行病学抽样调查筛查出的ADHD患儿中，采用随机数字表法选取158例为病例组，另在与ADHD患儿同一聚居区非ADHD者中选择性别、年龄匹配的159例为对照组。取外周静脉血5 ml，提取DNA。根据HapMap提供的存在于中国人群5-HT R2A基因的单核苷酸多态位点(SNPs)数据，及国内外相关文献，选择14个SNPs进行研究，并设计引物序列。PCR扩增，于反应终点判读基因型。结果病例组与对照组rs2770304、rs985934和rs6311位点的基因型分布不同，病例组CC/CT基因型频率高于对照组，TT基因型频率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。病例组rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位点关联等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。rs1745837、rs3742279和rs2296972位点两两间存在强连锁不平衡(D′和r2均大于0.95)，rs2770304、rs985934和rs4941573位点两两间存在较强连锁不平衡，rs2070040与rs6313、rs6311位点存在较强连锁不平衡。病例组单体型CCA、ACC频率高于对照组，单体型TTG、GTT频率低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论5-HT R2A基因rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位点多态性及单体型CCA、ACC、TTG、GTT可能与儿童ADHD的发生有关。

【关键词】注意力缺陷障碍伴多动；5-羟色胺；多态性,单核苷酸；连锁不平衡

梁友芳，农清清，覃健敏，等.儿童注意缺陷多动障碍与5-羟色胺R2A基因多态性的相关性研究[J].中国全科医学，2016，19(11)：1287-1291.[www.chinagp.net]

Liang YF,Nong QQ,Qin JM，et al.Association of 5-HT R2A gene polymorphism and attention deficit hyperactivity disorder in children[J].Chinese General Practice，2016，19(11)：1287-1291.

注意缺陷多动障碍(ADHD)是一种多见于学龄期儿童的精神障碍，主要表现为与其同龄儿童相比活动过度、注意力不集中，可伴有学习成绩低下和冲动行为[1]。目前ADHD的病因及发病机制尚不十分明确，但家系研究、双生子和寄养子研究结果显示，遗传因素是ADHD的重要发病因素，平均遗传度约为76%[2]。5-羟色胺(5-HT)系统相关受体均定位于与学习和记忆有关的脑区，如前额叶皮质、海马和杏仁核等[3]，20世纪70年代已有关于5-HT系统与ADHD关系的研究[4]，5-HT受体和5-HT转运体目前研究较多。有研究认为，5-HT系统相关基因的变异可能是ADHD的病因之一[5]。本研究选择5-HT R2A基因14个单核苷酸多态位点(SNPs)进行研究，探讨其基因多态性与ADHD之间的关联。

1对象与方法

1.1研究对象于2011年12月—2013年1月广西儿童ADHD流行病学抽样调查筛查出的ADHD患儿中，采用随机数字表法选取158例为病例组，其中男141例，女17例；年龄6.0～13.5岁，平均年龄7.8岁。病例组纳入标准：(1)符合《美国精神障碍诊断与统计手册》第四版(DSM-Ⅳ)[6]中ADHD的诊断标准；(2)3代内属本民族血缘；(3)取得患者及家属或法定监护人的同意，并签署知情同意书。排除患有儿童精神分裂症、情感障碍、孤独症、精神发育迟滞及其他器质性疾病者。在与ADHD患儿同一聚居区非ADHD者中选择性别、年龄匹配的159例为对照组，其中男139例，女20例；年龄6.0～14.0岁，平均年龄9.0岁。对照组纳入标准：(1)3代内属本民族血缘的健康人；(2)无严重躯体疾病、药物依赖史和其他精神疾病史；(3)自愿参加本研究并知情同意。两组受试者上代均无族间通婚史，亦无亲缘关系。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取取外周静脉血5 ml，置于EDTA试管抗凝,后保存于-20 ℃冰箱。采用DNA提取试剂盒提取DNA，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.2基因位点选择及基因分型根据HapMap提供的存在于中国人群5-HT R2A基因的SNPs数据，及国内外相关文献[7-9]，选择14个SNPs进行研究。采用Assay Designer 3.1软件进行引物设计，由博淼生物科技(北京)有限公司合成。采用 Sequenom Mass Array系统进行PCR扩增，于反应终点判读基因型。PCR在384孔板(包含10 ng DNA的5 μl体系)中进行。PCR循环参数：94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45个循环。

1.3统计学方法采用Haploview软件进行5-HT R2A基因多态位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验和连锁不平衡分析；采用SPSS 19.0软件包进行χ2检验分析5-HT R2A基因多态性与ADHD的关联。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Hardy-Weinberg遗传平衡检验经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，病例组和对照组各SNPs基因型频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律(P>0.05，见表1)，表明选择的样本具有群体代表性，基因频率能代表群体的基因分布。

表1　5-HT R2A基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验

注：SNPs=单核苷酸多态位点

2.2病例组与对照组5-HT R2A基因多态位点基因型和等位基因频率比较病例组与对照组rs2770304、rs985934和rs6311位点的基因型分布不同，病例组CC/CT基因型频率高于对照组，TT基因型频率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组余位点基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。病例组rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位点关联等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组余位点关联等位基因频率比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

2.35-HT R2A基因14个SNPs位点连锁不平衡分析当连锁不平衡系数(D′)和关联系数(r2)≥0.80时，表示两位点存在强连锁不平衡[10]。应用Haploview软件对14个SNPs位点两两间的连锁不平衡分析表明，rs1745837、rs3742279和rs2296972位点两两间存在强连锁不平衡(D′和r2均大于0.95)，rs2770304、rs985934和rs4941573位点两两间存在较强连锁不平衡，rs2070040与rs6313、rs6311位点存在较强连锁不平衡，rs6313和rs6311位点存在强连锁不平衡(D′=1，r2=0.98)。14个SNPs位点可构成3个单体型块，其中Block2和Block3两个单体块间存在强连锁不平衡，连锁不平衡系数为0.98(见图1)。

表2病例组和对照组5-HT R2A基因多态位点关联等位基因频率比较

Table 2Comparison of the frequency of alleles associated with SNPs in 5-HT R2A gene between case group and control group

SNPs关联等位基因关联等位基因频率病例组(n=158) 对照组(n=159)χ2值P值OR(95%CI)rs3125C0.1280.1031.0050.3161.29(0.79,2.11)rs7997012-0.6990.69901.0001.00(0.71,1.41)rs1923884C0.5630.5540.0490.8241.04(0.76,1.42)rs1745837C0.5700.5540.1530.6951.07(0.78,1.46)rs3742279G0.5630.5510.0970.7551.05(0.77,1.44)rs2296972T0.5730.5540.2140.6441.08(0.79,1.48)rs2224721A0.2660.2201.8190.1781.29(0.89,1.85)rs1928040C0.1940.1700.5860.4441.17(0.78,1.76)rs2770304C0.2180.1377.1410.0081.76(1.16,2.67)rs985934C0.2370.1566.5840.0101.68(1.13,2.51)rs4941573A0.3060.2284.8890.0271.50(1.05,2.14)rs2070040A0.2630.1914.5990.0321.51(1.04,2.20)rs6313C0.3150.2394.5790.0321.47(1.03,2.09)rs6311C0.3150.2315.6300.0181.54(1.08,2.19)

2.45-HT R2A基因多态位点构建的单体型分析14个SNPs共发现7个主要单体型(频率>5%)，病例组单体型CCA、ACC频率高于对照组，单体型TTG、GTT频率低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；两组余单体型频率比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

注：方块中的数字表示连锁不平衡系数D′

图15-HT R2A基因多态位点连锁不平衡分析

Figure 1Linkage disequilibrium analysis of SNPs in 5-HT R2A gene

表3病例组与对照组5-HT R2A基因多态位点构建的单体型频率比较

Table 3Comparison of the haplotype frequency of 5-HT R2A SNPs between case group and control group

单体型单体型频率病例组(n=158) 对照组(n=159)χ2值P值OR(95%CI)单体型块1 CGT0.5630.5450.2230.6371.08(0.79,1.47) TAG0.4240.4360.0960.7560.95(0.69,1.30)单体型块2 TTG0.6940.7735.0250.0250.66(0.46,0.95) CCA0.2170.1376.8400.0091.74(1.15,2.65) TTA0.0670.0710.0340.8530.95(0.51,1.77)单体型块3 GTT0.6830.7614.7520.0290.68(0.48,0.96) ACC0.2630.1914.5990.0321.51(1.04,2.20)

3讨论

研究表明，5-HT系统功能降低与攻击、冲动、ADHD等破坏性行为的发生有关[11]，目前关于5-HT在ADHD中的分子遗传学研究主要集中在5-HT受体和5-HT转运体。5-HT R2A是人体中重要的中枢神经递质，与人类行为、情绪调控等多种精神活动密切相关。5-HT R2A是一种抑制性受体，其T102C由T到C突变，可使5-HT2A的表达降低，从而使5-HT R2A结合力下降，神经元的兴奋性提高[12]。研究发现，5-HT R2A的T102C突变与ADHD发生有关[13]。5-HT R2A基因可影响认知功能，其启动子区-1438A/G多态性能够调节5-HT R2A启动子的活性，进而影响5-HT R2A基因的表达水平[14]。-1438A/G多态性与重型抑郁症、冲动行为相关[15-16]。钱秋谨等[17]报道5-HT R2A基因-1438A/G多态性是中国汉族ADHD患儿智商的影响因素。

人类5-HT R2A定位于第13号染色体长臂14～21区(13q14～21)，是由1 413个核苷酸开放阅读框架编码的471个氨基酸组成，基因跨度范围为20 kb，拥有3个外显子和2个内含子。目前共发现5-HT R2A基因存在6种多态性，包括2种静息多态性T102C和C516T，3种结构多态性Thr25Asn、His452Thr和Ala447Val，此外，5-HT R2A基因启动子区1 438位有A或G碱基变化，形成A1438G多态性[18]。本研究选择了14个SNPs位点，其中包括rs6313(T102C)和rs6311(G1438A)。本研究发现，与对照组比较，病例组rs6311(T102C)位点CC/CT基因型频率较高，TT基因型频率较低，提示CC/CT可能是ADHD发病的危险因素，TT可能是ADHD的保护因素，与侯雪等[13]报道的一致。病例组rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位点的关联等位基因频率均较高，提示上述位点可能与ADHD有关。

rs6313(T102C)多态性是位于外显子上的静息多态性，该位点的突变并不改变氨基酸序列，但可能影响mRNA的次级结构，且与其他多态性位点存在连锁不平衡。许多针对不同人群的研究证实，rs6313位点与启动子区的rs6311(G1438A)存在完全的连锁不平衡[19]。连锁不平衡分析是研究位点间关联性的一种方法，通过连锁不平衡分析可能有助于发现与研究内容关联的核苷酸多态性。本研究发现rs6313与rs6311、rs2070040位于同一单体型块，且与rs6311存在强连锁不平衡(D′=1，r2=0.98)，与rs2070040存在较强连锁不平衡。rs1745837、rs3742279和rs2296972位点位于同一单体型块，且两两间也存在很强的连锁不平衡(D′和r2均大于0.95)，rs2770304、rs985934和rs4941573位点位于同一单体型块，且两两间存在强连锁不平衡。但Heiser等[20]在102个家系的229例ADHD患者中未发现5-HT R2A rs6313、rs6314、rs6311多态性位点传递不平衡。同一单体型块中的SNPs间连锁不平衡，提示位点间没有发生重组，所有的SNPs有共同一并遗传的趋势。

单体型是指一条染色体上紧密连锁的多个等位基因的线性排列。大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型(每个具有至少5%的频率)，代表了一个群体中的大部分多态性，多态性位点单体型的构建则是这种遗传关联的体现，单体型的研究能够揭示多个SNPs与疾病等的关联[10]。本研究在病例组和对照组中发现了7个主要单体型(频率>5%)，其中病例组单体型CCA、ACC的频率高于对照组，单体型TTG、GTT的频率低于对照组，提示单体型CCA、TTG、GTT和ACC可能与ADHD存在一定的关联性。

综上所述，本研究结果提示5-HT R2A基因6个SNPs及4个单体型与ADHD的发生可能存在一定相关性。但ADHD是多基因遗传的复杂疾病，是多个基因交互作用的结果，而每个基因只发挥微效作用[21]，该结论尚需在其他地区、不同人群中进一步验证。

作者贡献：梁友芳、农清清、覃健敏进行课题设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；韦宏旷、郭尧平、范誉、班彩霞进行课题实施、评估、资料收集；李慕军进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：吴立波)

Association of 5-HT R2A Gene Polymorphism and Attention Deficit Hyperactivity Disorder in Children

LIANGYou-fang,NONGQing-qing,QINJian-min，etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the association between 5-HT R2A gene single nucleotide polymorphisms and attention deficit hyperactivity disorder(ADHD) in children.MethodsBy random number table method,we enrolled 158 ADHD children as case group,from ADHD children found in the ADHD epidemiological sampling survey among children in Guangxi Province conducted from December 2011 to January 2013.We also enrolled 159 children without ADHD with matching genders and ages among normal population in the same residential areas of children with ADHD as control group.From each subject,5 ml peripheral venous blood was sampled,and DNA was extracted.According to the data about SNPs in the 5-HT R2A gene of Chinese provided by HapMap and relevant literature published at home and abroad,we selected 14 SNPs and designed primer sequence.After PCR amplification,genotypes were determined at the reaction endpoint.ResultsCase group and control group were significantly different in the genotype distribution of rs2770304,rs985934 and rs6311 locus;case group was higher in the frequency of CC/CT genotype and lower in the frequency of TT genotype than control group(P<0.05).Case group was higher than control group in the frequency of alleles associated with rs2770304,rs985934,rs4941573,rs2070040,rs6313 and rs6311 locus(P<0.05).Strong linkage disequilibrium existed among rs1745837,rs3742279 and rs2296972 locus (D′ and r2 were both larger than 0.95),among rs2770304,rs985934 and rs4941573 locus,among rs2070040,rs6313 and rs6311 locus.Case group was higher in the haplotype frequency of CCA and ACC and lower in the frequency of haplotype TTG and GTT than control group (P<0.05).ConclusionThe polymorphism of rs2770304,rs985934,rs4941573,rs2070040,rs6313 and rs6311 locus and haplotype CCA,ACC,TTG and GTT of 5-HT R2A gene may be correlated with ADHD in children.

【Key words】Attention deficit disorder with hyperactivity；5-Hydroxytryptamine；Polymorphism,single nucleotide；Linkage disequilibrium

(收稿日期：2015-10-15；修回日期：2016-03-04)

【中图分类号】R 742.89

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.11.012

通信作者：农清清，530021广西南宁市，广西医科大学公共卫生学院；E-mail：nnqq26@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81360420)；广西自然科学基金面上项目(2011GXNSFA018294)；广西高等学校重点资助科研项目(201202ZD020)