甜玉米中游离糖及游离氨基酸的HPLC测定

马玉玲+牛丽影+李大婧+刘春泉+陈计峦

摘要： 采用高效液相色谱法（HPLC）对乳熟期甜玉米晶甜5号中的游离糖、氨基酸进行测定，检测到4种游离糖、18种游离氨基酸。游离糖为果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，含量分别为18.54、28.36、56.13、0.09 mg/g。游离氨基酸中，甜味氨基酸丙氨酸的含量（9.70 mg/g）最高，其次为鲜味氨基酸谷氨酸（3.19 mg/g）、天冬酰胺（2.62 mg/g），功能性氨基酸γ-氨基丁酸的含量为0.18 mg/g。本研究结果将为甜玉米的风味及营养评价提供依据。

关键词： 甜玉米；游离糖；游离氨基酸；测定

中图分类号： TS201.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0300-03

甜玉米因其味甜、口感鲜嫩、营养丰富而深受消费者喜爱，被称为果蔬玉米[1]。游离糖、游离氨基酸是果蔬中重要的呈味成分和风味前体物[2]，也是贮藏加工过程中易损失变化的成分。目前，我国对玉米中糖的研究大多关于还原糖或总糖量计[3]；对氨基酸的测定多为水解氨基酸，即总氨基酸或蛋白氨基酸[4]，尚无游离氨基酸的报道。

本研究以超甜玉米晶甜5号[5]为材料，采用高效液相色谱法（HPLC）定性定量测定玉米籽粒中游离糖、游离氨基酸的含量，为鲜食玉米的风味及营养评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

晶甜5号甜玉米采自江苏省南京市六合区农业科学院种植基地，于吐丝后22 d采摘。采收当日手工去苞皮，分离籽粒，混合后于液氮中速冻，置于-20 ℃冰箱中冻藏待测。

1.2 试剂

氨基酸混合标样、3-巯基丙酸、邻苯二甲醛（OPA）购自美国Sigma公司。考马斯亮蓝-G250、氯仿、甲醇、硼酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠、无水乙醇、磷酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。色谱级乙腈、甲醇购自美国天地公司。

1.3 仪器与设备

HPLC1200型高效液相色谱仪（美国Agilent科技有限公司），主要包括在线真空脱气机、四元梯度洗脱泵、柱温箱、二级管阵列检测器（diode array detector，DAD）、示差折光检测器（refractive index detector，RID）。RE52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（上海东玺制冷仪器设备有限公司），B-220型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）等。

1.4 试验方法

1.4.1 可溶性糖的测定 参照Giannoccaro等的方法[6]进行可溶性糖的测定。取2.0 g冷冻玉米粒，加入20 mL 80%的乙醇并研磨成匀浆，于10 000 g（4 ℃）离心15 min，用10 mL 80%的乙醇提取2次滤渣，合并溶液，于60 ℃真空条件下旋转蒸发浓缩至低于2 mL左右，补蒸馏水至6 mL，混匀后于 10 000 g（4 ℃）离心10 min，取上清液1 mL并加入1 mL乙腈，过0.45 μm的滤膜，供HPLC进样分析。HPLC分析色谱柱为Carbohydrate色谱柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm），示差（RID）检测器，流动相为乙腈-水（体积比75 ∶ 25）、流速 1.0 mL/min、检测器温度（30.0±0.8） ℃、柱温（30.0±0.8） ℃、运行时间10 min、进样量20 μL。通过与标准样品保留时间的比对、外标法分别进行定性定量。

1.4.2 游离氨基酸的测定 采用OPA衍生法[7]进行游离氨基酸的测定。取2.0 g冷冻玉米粒，加入氯仿-甲醇（15 ∶ 35）溶液10 mL，在液氮条件下研磨成匀浆，用8 mL水提取游离氨基酸，提取3次后合并水层，在冰上静置30 min后取上层清液10 μL，加入50 μL（0.4 moL/L、pH值10.2）硼酸缓冲液，并加入10 μL OPA衍生，混匀后静置30 s，加入640 μL蒸馏水并混匀，过0.45 μL有机微孔滤膜，进样量为20 μL。HPLC色谱检测条件如下，色谱柱为ZORBAX Eclipse-AAA色谱柱（150.0 mm×4.6 mm，3.5 μm），检测器为DAD；流动相A为0.040 moL/L、pH值7.8的NaH2PO4溶液，流动相B为乙腈-甲醇-水（体积比45 ∶ 45 ∶ 10）；流速为 2 mL/min；洗脱梯度为0% B（0 min）、0% B（1.9 min）、57% B（18.1 min）、100% B（18.6 min）、100% B（22.3 min）、0% B（23.2 min），0% B（26.0 min，保持至26.0 min）；柱温为（40.0±0.8） ℃；UV灯波长为（338±10） nm，参比波长为（390±20） nm；峰宽>0.03 min（0.5 s）；狭缝为4 nm；进样量为20 μL。

1.5 统计与分析

采用Excel 2003、OriginPro 8.6、SAS软件对试验数据进行整理、作图、组间差异的Duncan氏多重比较，每个样品重复测定3次。

2 结果与分析

2.1 游离糖

晶甜5号超甜玉米中共检出果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖4种游离糖（图1）。蔗糖含量最高，葡萄糖、果糖次之，麦芽糖含量最少，蔗糖含量分别是果糖、葡萄糖含量的3.03、1.98倍（表1）。本结果与国外学者对超甜玉米中糖含量的测定结果相似，均以蔗糖含量最高，果糖与葡萄糖含量接近，但因品种和测定方法的不同存在一定差异。Jubilee品种中果糖与葡萄糖的比值为0.85，蔗糖 ∶ 果糖、蔗糖 ∶ 葡萄糖则分别为689、4.78[8]。Bunker Hill品种中果糖与葡萄糖的比值为088，蔗糖 ∶ 果糖、蔗糖 ∶ 葡萄糖则分别为11.47、10.14[9]。目前，关于我国鲜食玉米中游离糖组成的研究较少。赵福成等对扬甜2号、超甜135玉米籽粒发育的糖分积累变化进行研究，检测到甘露醇和山梨醇[10]，而本研究并未检出，可能与检测方法的不同有关。糯玉米（垦糯1号）中糖的组成与甜玉米差别很大，果糖、葡萄糖的含量远高于蔗糖[11]。

2.2 游离氨基酸

目前对玉米中氨基酸的研究，多采用盐酸水解法测定干基中蛋白氨基酸或氨基酸的总量。白宝璋测定的几个甜玉米品种中，必需氨基酸约占总氨基酸的50%，且含量最高的为谷氨酸[4]。水解氨基酸常用于蛋白的营养评价[12]，游离氨基酸则更多作为滋味成分[13-14]，是果蔬产品的重要特征指标。

由图2、表2可知，本研究检测的19种游离氨基酸中，晶甜5号甜玉米未测定到半胱氨酸。其中，亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸7种必需氨基酸共占总氨基酸的13.88%。本研究中检测到的18种游离氨基酸中，含量最高的为丙氨酸（9.70 mg/g），其次为谷氨酸（3.19 mg/g）、天冬酰胺（2.62 mg/g）。据报道， 天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺为鲜味氨基酸；甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸为甜味氨基酸；亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋（甲硫）氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸为苦味氨基酸；赖氨酸、酪氨酸对口味贡献很低[13]。以各种呈味氨基酸的总量计算，晶甜5号甜玉米中甜味氨基酸含量最高，占氨基酸总量的54.91%；其次为鲜味氨基酸，占氨基酸总量的24.54%；苦味氨基酸在总氨基酸中的含量相对较低，仅为13.90%。蔬菜的呈味氨基酸研究中，以蘑菇和番茄的研究最多。Li等对7个品种的蘑菇进行测定，其游离氨基酸总量在4.09～22.73 mg/g，必需氨基酸的含量在19.16%～35.58%，含量最高的为谷氨酸（0.67～3.97 mg/g）或丙氨酸（0.96～3.46 mg/g）[13]。在番茄中，随着番茄成熟度和鲜味强度的增加，谷氨酸、谷氨酰胺含量呈明显上升趋势，从绿熟期至红熟期至完全成熟，其含量分别为3.85～41.10、33.50～80.23 mg/100 g 鲜质量[14]。晶甜5号甜玉米中，甜味氨基酸和鲜味氨基酸在总氨基酸中的比例最高，并具有较高的含量，由此推测游离氨基酸对晶甜5号甜玉米的口味具有重要作用。

另外，γ-氨基丁酸也是值得关注的氨基酸之一。GABA作为一种非蛋白氨基酸，近年来因其生理功能而受到关注。据报道，植物组织中GABA的含量通常在0.3～32.5 μmol/g，即0.03～3.36 mg/g，在通过发芽富集的京甜紫花糯玉米中可达到0.65 mg/g[15]，而晶甜5号甜玉米中GABA的含量为0.18 mg/g。

3 结论

晶甜5号甜玉米中的游离糖主要有果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，其中蔗糖含量最高，葡萄糖、果糖次之，麦芽糖含量最低。检测到18种游离氨基酸中含量最高的为甜味氨基酸丙氨酸，其次为鲜味氨基酸谷氨酸、天冬酰胺，且甜味氨基酸甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸之和为氨基酸总含量的 54.9%，鲜味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺之和为氨基酸总含量的24.5%；另外检测到较高含量的GABA。

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