苇蘑液体菌种培养基的优化

王翟，赵安，班立桐，黄海东，郭雅聪，杨红澎，王玉，黄亮

（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300384）



苇蘑液体菌种培养基的优化

王翟，赵安，班立桐，黄海东，郭雅聪，杨红澎，王玉，黄亮通信作者

（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300384）

摘 要：通过比较观察相应的种子液中菌丝球的生长状况及其菌丝球数量、干重等指标，从4种发酵培养基中选出最适合苇蘑菌丝生长的初始发酵培养基，并采用L9(34)正交试验对该培养基进行了优化，确定发酵培养基配方为：葡萄糖15 g/L、乳糖15 g/L、酵母膏4 g/L，自然条件下的pH值。通过最适培养基培养后，苇蘑菌丝干重提高到18.26 g/L。

关键词：苇蘑；正交试验；菌丝干重；菌丝球

苇蘑为蜡伞科(Hygrophoropsidaceae)、拟蜡伞属（Hygrophoropsis）蘑菇[1]，产于天津市宁河县七里海地区芦苇地。苇蘑属于一种野生食用菌，具有极鲜美的味道，尤其干品具有独特的浓郁香气。苇蘑作为一种可再生资源，利用好则可以永续利用，但利用过度，资源会趋向枯竭以至灭绝。另外，其利用价值越大，其过度的破坏性利用程度也就越大[2]。目前，市场上未见苇蘑相关的开发产品，且对于该物种的研究主要集中在本研究室[3-4]，这主要是因为野生苇蘑数量稀少，尚未实现人工栽培。因此，通过液体培养来快速获得苇蘑菌丝球，并筛选出较优的发酵培养基，对苇蘑的生态开发及资源利用具有重要的实践意义。

1 材料与方法

1.1 菌种

苇蘑，分离于野生苇蘑子实体，保藏于天津农学院农业微生物实验室。

1.2 培养基

（1）斜面培养基（草炭土培养基，g/L）：草炭土600、麦粒100、MgSO4·7H2O 1.5、KH2PO41、蛋白胨2、葡萄糖20、琼脂20。

（2）种子培养基（g/L）：葡萄糖15、乳糖15、酵母膏6，pH值调至6，115 ℃灭菌20 min。

（3）基础发酵培养基（g/L）配方如下：

配方一：葡萄糖20、K2HPO40.1、蛋白胨2、MgSO40.5、酵母膏1、KH2PO40.4。

配方二：葡萄糖10、乳糖10、酵母膏4。

配方三：大豆粉30、K2HPO41、蛋白胨3、酵母膏1、KH2PO40.5、VB10.03 mg。大豆粉需要单独清水煮沸15 min后用纱布过滤，之后取滤液备用。

配方四（草炭土培养基）：草炭土600、麦粒100、MgSO4·7H2O 1.5、KH2PO41、蛋白胨2、葡萄糖20。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

将新鲜斜面菌种切成小块，每块0.5 cm2。取2块接至种子培养基（100 mL/250 mL三角瓶）中，每个瓶子中接入5块。放置于摇床中，25 ℃，150 r/min培养4～7 d。

1.3.2 发酵培养

以5%（v/v）接种量将种子转接于新鲜的发酵培养基（100 mL/250 mL三角瓶）中，25 ℃下，摇床转速为150 r/min，培养7 d。培养基成分根据试验方案逐次改变。

综合不同配方下的苇蘑菌丝干重及菌丝球数，确定最佳基础发酵培养基。

1.3.3 最适培养基的正交试验设计

以通过摇瓶培养试验初步选定的培养基配方二，继续在摇瓶中对苇蘑进行液体种子培养。设计了L9(34)正交试验（表1），以确定深层培养的液体种子培养基最佳配方。以菌丝体干重及菌球数为指标，每组2个重复。

表1 正交试验设计表[5]

1.3.4 菌丝体干重的测定

采用细胞干重法测定。取发酵液，3 000 r/min离心15 min，收集菌丝体，并用蒸馏水洗涤2次后，将菌丝体放在已干燥好的培养皿中，置于80 ℃下烘至恒重，称量。

1.3.5 菌球数测定

将摇瓶中的发酵液摇匀，快速吸取l0 mL发酵液置于90 mm的配养皿中摊匀，重复3次，用方格法计数，并计算出每瓶菌球总数。

2 结果与分析

2.1 初始发酵培养基的确定

采用4种基础发酵培养基进行棕色蘑菇菌丝培养7 d后，所得菌丝量见表2。由表2看出，在相同培养条件下，不同培养基对苇蘑菌丝体的生长状况有一定影响，其中配方二培养的苇蘑菌丝体干重最大，且菌丝球数较多。作为液体菌种，菌丝量越多，越有利于后续的菌体生长，菌球数多可增加转接后的菌丝萌发点。故综合考虑，采用菌丝生长较好且菌球数最多的配方二进行下一步的优化。

表2 不同培养基的苇蘑菌丝生长情况

2.2 以苇蘑菌丝干重为指标的摇瓶培养培养基的优化

由表3看出，由极差分析得出的最优水平组合为A3B3C2，即：葡萄糖15 g，乳糖15 g，酵母膏4 g，水1 000 mL，自然条件下pH值。通过极差比较，各因素对苇蘑菌丝产量影响为：葡萄糖＞乳糖＞酵母膏。

表3 菌丝干重的正交分析结果

2.3 以苇蘑菌丝球数为指标的摇瓶培养培养基的优化

据不同液体培养基配方配制苇蘑种子液，接种后于摇床上恒温振荡培养5 d后，对种子液中生成的菌球进行计数[6]（表4），将摇瓶中的发酵液摇匀，取l0 mL发酵液置于90 mm的配养皿中摊匀，重复3次，用方格法计数，并计算出每瓶菌球总数，最终以每瓶培养基中形成的菌球数多少来选择液体培养基配方。

表4 菌丝球数的正交分析结果

由上述的极差分析得出，最优水平组合为A3B3C2，即：葡萄糖15 g，乳糖15 g，酵母膏4 g，水1 000 mL，自然条件下pH值。与以菌丝干重为指标分析得出的结果相同，可见菌丝干重与菌丝球数有一定的相关性。通过极差比较，各因素对苇蘑菌丝球数影响大小为：乳糖＞酵母膏＞葡萄糖，与各因素对苇蘑菌丝体的影响顺序不同，主要原因在于：葡萄糖属于快速利用碳源，在菌丝初期生长阶段作用较大，可在短时间内增加菌丝产量，故以菌丝体干重为指标时葡萄糖的影响最大；而菌丝球为真菌液体培养一段时间后的特化形态，菌丝生长一般在培养后期葡萄糖利用完后再利用乳糖（缓慢利用碳源），故乳糖对菌丝球数的影响高于葡萄糖。后续研究可根据实际需要调整两种糖的比例来加速苇蘑不同生长阶段的培养过程。

3 讨论与结论

液体菌种制作技术是食用菌生产中一项新型制作方式，它是生物发酵技术在农业生产上的应用。随着食用菌生产技术的发展和生产的规模化、工厂化、现代化程度的提高，液体菌种制作技术将越来越具有广泛的推广价值[6]。目前液体菌种已经用于栽培金针菇、蟹味菇、平菇等菇种，且在工厂化栽培金针菇中已经形成产业化，而把液体菌种快繁技术应用于苇蘑的发酵培养还未见报道[7]。

液体菌种与固体菌种相比，具有菌种生产周期短、菌龄整齐一致、菌丝活力强、接种方便、不宜感染杂菌等优点，接于固体培养料内，流动性好，萌发点多，具有很好的开发应用前景[8]。本试验通过正交设计确定出了最适的液体培养基配方，在此配方下进行苇蘑液体摇瓶培养获得的菌丝球数量多，菌丝产量提高至18.26 g/L，与原配方的6.66 g/L相比，提高了1.74倍。

参考文献：

[1]杨红澎，黄亮，班立桐，等.天津七里海野生苇蘑科属研究[J].天津农业科学，2013，19（5）：51-52.

[2]王秀云，孔爱琴.博斯腾湖野生苇蘑调查研究[J].干旱区研究，1987（4）：62-63.

[3]班立桐，杨红澎，吴疆，等.野生苇蘑不同活性组分的体外抗氧化作用研究[J].食用菌，2010（3）：72-73.

[4]班立桐，杨红澎，吴疆，等.超声波法提取苇蘑多糖的工艺研究[J].食品研究与开发，2011，3（3）：38-41.

[5]黄亮，王玉，胡炳旭，等.正交设计法筛选紫芝菌丝液体培养基的研究[J].天津农学院学报，2010，17（2）：14-17.

[6]王瑞娟，郭倩，李玉，等.一种灰树花液体菌种及用其栽培灰树花的方法：200910201986[P].2010-06-16.

[7]刘永，刘永宝，刘振富.液体菌种专用培养基及使用方法：201010291375[P].2011-01-26.

[8]毛先兵，朱华，李叶敏，等.一种北冬虫夏草液体菌种的生产方法：200910103625[P].2010-10-20.

Optimization of Liquid Medium for Weimo Mycelium

WANG Di,ZHAO An,BAN Li-tong,HUANG Hai-dong,GUO Ya-cong,YANG Hong-peng,WANG Yu,HUANG LiangCorrespongding Author
（College of Agronomy and Resource Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China）

Abstract:By comparing the mycelium growth,mycelium pellets number and mycelium dry weight of Weimo,the most suitable initial fermentation medium for Weimo was selected from the four types of fermentation culture medium.Then L9(34) orthogonal experiment design was employed to optimize the medium.The determined fermentation medium as the following: glucose 15 g/L,lactose 15 g/L,yeast paste 4 g/L and the nature pH value.The dry mycelium weight of Weimo can reach to 18.26 g/L with the optimum culture medium.

Key words:Weimo; orthogonal experiment; dry mycelium weight; mycelium pellet

通信作者：黄亮（1983-），男，江苏沭阳人，副教授，硕士，主要从事微生物发酵及食用菌相关研究。E-mail：huangliang@tjau.edu.cn。

作者简介：王翟（1993-），女，辽宁抚顺人，本科在读，主要从事生物技术专业方面研究。E-mail：1172121661@qq.com。

基金项目：国家级大学生创新训练计划项目“苇蘑发酵条件优化及多糖口服液的研发”（201510061049）；天津市高等学校科技发展基金计划项目“苇蘑液体发酵条件优化及多糖活性的研究”（20140607）

收稿日期：2015-10-16

文章编号：1008-5394（2016）01-0043-03

中图分类号：S646.9

文献标识码：A