急性白血病患者外周血T细胞亚群、NK细胞和调节性T细胞的检测及临床意义

张司琪，葛 健，夏瑞祥

急性白血病患者外周血T细胞亚群、NK细胞和调节性T细胞的检测及临床意义

张司琪，葛 健，夏瑞祥

目的了解急性白血病（AL）患者外周血 T淋巴细胞亚群、自然杀伤（NK）细胞和调节性 T细胞（Treg）的水平及不同时期的变化，并探讨其临床意义。方法采用流式细胞术对 AL初诊患 者 （93例 ）、异 基因 造 血 干细 胞 移 植 （Allo-HSCT）者（9例）及正常健康对照者（30例）外周血 CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+／CD8+比值、NK细胞和 CD4+CD25+CD127lowTreg进行 检测。结果初诊 AL患者 CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD4+／CD8+比值和 NK细胞低于正常对照者（P＜0.05），Treg细胞高于正常对照者（P＜0.05）；AL患者治疗后达完全缓解（CR）者 CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD4+／CD8+比值、NK细胞及 Treg细胞可逐渐恢复，但 NK细胞恢复缓慢，Treg细胞在缓解早期较治疗前增高，但差异无统计学意义；Allo-HSCT患者 CD4+T细胞水平和 CD4+／CD8+比值明显低于正常对照者（P＜0.05），CD8+T细胞水平明显高于正常对照者（P＜0.05）。结论AL患者存在细胞免疫功能紊乱，动态检测 T淋巴细胞亚群、NK细胞及 Treg对了解 AL患者细胞免疫功能及免疫调节治疗有一定的临床价值。

急性白血病；T淋巴细胞亚群；NK细胞；调节性 T细胞

急性白血病（acute leukemia，AL）是起源于造血干细胞的克隆性恶性血液病，其发生发展与机体免疫紊乱密切相关，尤其是细胞免疫异常。T淋巴细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞是细胞免疫的重要组成部分，在抗肿瘤效应中发挥重要作用。调节性 T细胞（regulatory T cell，Treg）有免疫调节功能，在肿瘤环境中能够抑制抗肿瘤免疫。该研究对93例初诊 AL患者、9例异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT）患者和 30例健康对照者进行外周血 T淋巴细胞亚群、NK细胞及 Treg细胞水平进行检测，并动态观察其在AL患者治疗前后的变化。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取 2014年 7月 ～2015年 6月于安徽医科大学第一附属医院血液内科确诊的93例初诊 AL患者（AML 73例，ALL 17例，MPAL 3例），其中男 56例，女 37例，年龄 14～84（50.7± 17.57）岁；9例 AL Allo-HSCT者，其中男 7例，女 2例，年龄 25～43（30.67±6.38）岁。正常对照者 30例，其中男 17例，女 13例，年龄 21～54（32.13± 10.00）岁，均为医院体检中心健康体检者。

1.2 主要试剂和仪器鼠抗人单克隆抗体：CD4-PB、CD8-APC、CD3-FITC／CD（16+56）PE、CD45-KO、CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE，溶血素，磷酸盐缓冲液（PBS），水平离心机，旋窝振荡器，Navios流式细胞仪（美国 Beckman Coulter公司）。

1.3 标本的制备清晨收集研究对象空腹外周静脉血 3 ml，置于肝素抗凝管中，混匀后取 2 ml于离心管，置离心机中，1 500 r／min离心 5 min，吸除最上层血浆后充分混匀。取两支 BECKMAN离心管，各加入混匀的去血浆抗凝血 100μl，分别编号为试管 1和试管 2，试管 1中加入 10μl CD4-PB、CD8-APC、CD3-FITC／CD（16+56）PE、CD45-KO，试管 2中加入 10μl CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE，涡旋混匀，室温避光放置 15 min。取出后向两支试管中各加入 1 ml溶血素，旋窝混匀，避光放置 15 min。取出置离心机中，1 500 r／min离心 5 min后，弃去上清液，各加入 0.5 ml PBS溶液旋窝混匀后直接上机，每管收集 2 000个淋巴细胞。

1.4 T淋巴细胞亚群及NK细胞的检测方法（试管1）首先在 FSC-SSC散点图上圈定淋巴细胞群，以CD45+／SSC射门，选择 CD45阳性且SSC较小的细胞区，其中 CD3阳性且 CD4阳性者为CD4+T细胞群，CD3阳性且 CD8阳性者为 CD8+T细胞群，CD3不表达且 CD（16+56）高表达者为 NK细胞，检测结果以各类细胞占总淋巴细胞的百分率表示。

1.5 Treg的检测方法（试管2）首先在 FSC-SSC散点图上圈定淋巴细胞群，再以 CD4+／SSC射门，选择 CD4阳性且 SSC较小的细胞区，其中 CD25阳性而 CD127低表达者为 CD4+CD25+CD127lowTreg。

1.6 统计学处理应用 SPSS 19.0统计软件进行分析，数据用 ¯x±s表示；多组均数的比较采用方差分析，方差齐时采用 LSD检验，方差不齐采用 Dunnett′s T3检验两两比较各组间差异。

2 结果

2.1 AL患者基本情况93例初诊 AL患者诱导治疗后完全缓解（CR）者 55例，部分缓解（PR）者 9例，未缓解者 19例，死亡者 3例，放弃治疗者 7例。55例 CR者为 AL CR（1个月）组。3个月后仍 CR者 49例，复发两例，失访 4例，该 49例为 AL CR（3个月）组。19例未缓解者为 AL未缓解组。

2.2 A llo-HSCT者基本情况9例 AL Allo-HSCT者为 AL移植组，均为移植 3～18个月后来我院复查患者，其造血干细胞来源分别为亲缘全相合6例，亲缘非全相合移植 2例，非亲缘脐血干细胞移植 1例。检测时患者均处于 CR状态，其中 3例患有慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host disease，cGVHD），两例表现以皮疹为主，1例表现以腹泻及肝功能异常为主。

2.3 T淋巴细胞亚群检测结果初诊 AL组、AL CR（1个月）组、AL CR（3个月）组、AL未缓解组、AL移植组和正常对照组 T细胞亚群的具体检测结果见表 1，其中 CD3+T细胞水平、CD4+T细胞水平和 CD4+／CD8+比值满足方差齐性，6组间均数差异均有统计学意义（F=6.538、28.513、17.348，P＜0.05），CD8+T细胞水平不满足方差齐性，6组间均数差异有统计学意义（F=22.498，P＜0.05）。组间两两比较结果显示：初诊 AL组和 AL未缓解组CD3+T细胞百分比、CD4+T细胞百分比、CD4+／CD8+比值均明显低于正常对照组（P＜0.05），CD8+T细胞百分比均高于正常对照组，但差异无统计学意义；AL CR（1个月）组及 AL CR（3个月）组患者T淋巴细胞亚群与正常对照组无明显差异，CD3+T细胞百分比、CD4+T细胞百分比、CD4+／ CD8+比值均高于初诊 AL组（P＜0.05），CD8+T细胞百分比低于初诊 AL组，但差异无统计学意义；AL移植组 CD3+T细胞百分比与正常对照组无明显差异，CD4+T细胞百分比、CD4+／CD8+比值均明显低于正常对照组（P＜0.05），CD8+T细胞百分比明显高于正常对照组（P＜0.05）。见表1。

2.4 NK细胞检测结果各组 NK细胞占总淋巴细胞的 百 分 率 分 别 为：初 诊 AL组 （11.84% ± 6.65%），AL CR（1个月）组（12.34% ±7.18%），AL CR（3个月）组（14.96% ±7.40%），AL未缓解组 （11.87% ±7.22%），AL移 植 组 （16.33% ± 6.67%），正常对照组（16.30% ±6.10%），满足方差齐性，6组间均数差异有统计学意义（F=3.319，P＜0.05）。组间两两比较结果示：初诊 AL组和 AL未缓解组NK细胞百分比均明显低于正常对照组（P＜0.05）；AL CR（1个月）组 NK细胞百分比仍低于正常对照组（P＜0.05）；初诊 AL组和 AL CR（1个月）组 NK细胞水平无明显差异；AL CR（3个月）组NK细胞百分比接近正常对照组，高于初诊 AL组（P＜0.05）；AL移植组 NK细胞百分比与正常对照组无明显差异。见表1。

2.5 Treg检测结果各组 Treg细胞占 CD4+T细胞的百分率分别为：初诊 AL组（8.31% ±3.74%），ALCR（1个月）组（9.67% ±3.81%），AL CR（3个月）组（6.69% ±2.99%），AL未缓解组（10.33% ± 3.52%），AL移植组（6.83% ±3.85%），正常对照组（6.33% ±2.62%），不满足方差齐性，6组间均数差异有统计学意义（F=6.536，P＜0.05）。组间两两比较结果示：初诊 AL组、AL CR（1个月）组及 AL未缓解组 Treg百分比明显高于正常对照组（P＜0.05）；AL CR（1个月）组及未缓解组 Treg百分比均高于初诊 AL组，但差异无统计学意义；AL CR（3个月）组 Treg百分比与正常对照组无明显差异，明显低于 AL CR（1个月）组（P＜0.05）及 AL未缓解组（P＜0.05）；AL移植组 Treg水平与正常对照组无明显差异。见表1。

3 讨论

T淋巴细胞有辅助功能、杀伤功能和抑制功能，其各亚群之间的平衡状态与机体的免疫功能密切相关。CD3是 T细胞表面的重要标志，CD3+细胞可用于计数 T淋巴细胞总数。T细胞亚群包括 CD4+T细胞群和 CD8+T细胞群。CD4+T细胞亚群有免疫协调功能，CD8+T细胞亚群有免疫抑制作用和杀伤靶细胞的功能，CD4+／CD8+比例稳定对维持细胞免疫反应平衡至关重要。本实验结果显示 AL患者CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD4+／CD8+比值均明显低于正常对照组，提示 AL患者存在 T淋巴细胞平衡紊乱，细胞免疫功能受到抑制。AL CR患者 T细胞亚群各抗原比例接近正常，提示机体细胞免疫功能得到一定程度的恢复。化疗是治疗 AL的常规手段，Allo-HSCT是 AL患者长 期存活 的有效 治疗方法。研究［1］显示，化疗对细胞免疫有抑制作用，免疫调节剂（如 IL-2）能够改善化疗后白血病患者 T细胞亚群水平。Allo-HSCT患者通过大剂量化疗预处理，再回输供者造血干细胞，重建免疫系统，并且需长期使用激素和免疫抑制剂，以防治 GVHD。国内外研究［2-3］显示，Allo-HSCT患者移植后 CD8+T细胞恢复较快，CD4+T细胞恢复较慢，导致 CD4+／CD8+比值 长 期 倒 置。本 实 验 结 果 显 示 AL Allo-HSCT患者 CD4+T细胞比值明显降低，CD8+T细胞比值明显增高，CD4+／CD8+比值严重倒置，与研究［2-3］结果一致，提示 AL患者移植后机体细胞免疫功能长期处于抑制状态。

表1 AL患者 T淋巴细胞亚群、NK细胞及 Treg水平（¯x±s）

NK细胞有细胞毒功能和免疫调节功能，是感染和抗肿瘤免疫的第一道天然防线［4］。一项对 42例 AL患儿的研究［5］显示，AL患儿在疾病发生和治疗过程中存在细胞免疫功能异常，治疗并获得 CR后，患儿细胞免疫功能可逐渐恢复，但 NK细胞水平恢复缓慢，获得 CR一年后 NK细胞水平仍未达到正常。本研究结果显示 AL初诊患者 NK细胞水平低于正常对照者，提示初诊 AL患者 NK细胞免疫功能受损，AL CR患者诱导治疗 1个月后 NK细胞水平未见明显升高，诱导治疗 3个月后接近正常，提示NK细胞恢复速度相对缓慢，与上述研究［5］结果一致。

Treg有免疫抑制性和免疫无能性，其增高或减低与多种机体病理状态相关。Treg细胞高表达可能与多种恶性肿瘤性的不良预后相关［6］，而低表达则与免疫性血小板减少症、溃疡性结肠炎等多种免疫相关性疾病相关［7-8］。研究［9］表明 Treg可以抑制抗肿瘤免疫。本研究显示 AL初诊患者 Treg较正常对照者明显增高，提示 AL患者抗肿瘤免疫受到抑制。而本研究中 ALCR（1个月）组及 AL未缓解组Treg细胞均高于治疗前水平，但差异无统计学意义，提示AL患者诱导治疗后机体免疫可能进一步受抑。可能是因为化疗本身对机体免疫功能有负作用。Treg细胞水平还与 aGVHD相关。Magenau et al［10］的临床实验提示 Treg细胞水平可作为 aGVHD的生物预测标志。傅华睿 等［11］发现，Allo-HSCT患者在血象恢复后3～5 d，Treg／CD4+T细胞比例小于7% 时，发 生 aGVHD 的 风 险 增 大。本 实 验 Allo-HSCT者均为移植 3个月后 AL患者，其 Treg水平与正常对照者无明显差异，可能是因为病例数较少，以及未对移植患者进行无 GVHD和 cGVHD分组比较相关。早期和动态监测移植患者 Treg细胞水平可进一步了解 Allo-HSCT患者免疫重建过程及细胞免疫水平。

Treg细胞可能参与 T细胞亚群和 NK细胞的调节。研究［12］显示，Treg可以通过促进 CD8+T细胞免疫应答，抑制 NK细胞免疫应答，参与急性髓系白血病的发生发展。本实验结果显示 AL初诊组 Treg细胞水平高于正常对照组，NK细胞水平低于正常对照组，AL CR（3个月）组 Treg细胞及 CD8+T细胞水平降低，NK细胞水平升高。但 AL CR（1个月）组Treg细胞百分比较治疗前稍升高，而 NK细胞水平未见下降，CD8+T细胞水平未见升高，提示 Treg细胞与 CD8+T细胞、NK细胞并非绝对相关，其之间的关系及机制有待进一步的研究。

综上所述，AL患者在疾病发生及治疗过程中存在细胞免疫功能紊乱，经治疗并获得 CR后细胞免疫功能可逐渐恢复。动态检测 T淋巴细胞亚群、NK细胞及 Treg可反应机体细胞免疫水平，临床上对了解患者细胞免疫功能及免疫调节治疗有一定价值。治疗过程中根据患者 T淋巴细胞亚群、NK细胞及Treg水平，适当应用免疫调节剂可能有助于患者恢复。

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Detection of T lymphocyte subsets，NK cells，regulatory T cells in peripheral blood of patientswith acute leukem ia and its clinical significance

Zhang Siqi，Ge Jian，Xia Ruixiang
（Dept of Hemotology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To study the levels of T lymphocyte subsets，NK cells，regulatory T cells in peripheral blood of patients with acute leukemia，and the changes in different periods，and to explore its clinical significance. Methords To detect the level of peripheral blood of CD3+T cells，CD4+T cells，CD8+T cells，CD4+／CD8+ratio，NK cells and CD4+CD25+CD127lowTreg in 93 newly diagnosed AL patients，9 AL patients after Allo-HSCT and 30 normal controls by using flow cytometry.Resu lts The percentages of CD3+T cells，CD4+T cells，NK cells and the ratio of CD4+／CD8+in newly diagnosed AL patients were much lower than the normal controls（P＜0.05），and Treg in newly diagnosed AL patientswasmuch higher than the normal controls（P＜0.05）.The levels of CD3+T cells，CD4+T cells，CD4+／CD8+ratio，NK cells and Treg in the patients achieved CR were gradually close to the normal controls.But the recovery rate of NK cells was slow，and the level of Treg in early CR period was increased than that of before induction therapy，but it had no statistically significant difference.The level of CD4+T cells and the ratio of CD4+／CD8+in the group of Allo-HSCTwere significantly lower than the normal controls（P＜0.05），and the level of CD8+T cells in the group of Allo-HSCT was significantly higher than the normal controls（P＜0.05）.Conclusion Cellular immune function is disordered in patientswith AL.Dynamic detection of T lymphocyte subsets，NK cells，regulatory T cells are clincially value on investigating cellular immune function and immune regulation therapy in patientswith AL.

acute leukemia；T lymphocyte subsets；NK cells；regulatory T cells

R 733.71

A

1000-1492（2016）02-0218-04

时间：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.030.htm l

2015-11-06接收

国家自然科学基金（编号：81200371）；高等学校博士学科点专项科研基金联合资助课题（新教师类联合资助课题）（编号：20123420120011）；安徽省自然 科学基金（编号：1208085QH154）

安徽医科大学第一附属医院血液内科，合肥 230022

张司琪，女，硕士研究生；

葛 健，男，副教授，副主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：gejian77＠medmail.com.cn；

夏瑞祥，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：xrx2041＠163.com