姜黄素与索拉非尼联合对人肾癌细胞株786-O增殖抑制作用的体外研究

赵建通　张磊　刘文瞻　徐飞　郭明涛　路志民　肖波



姜黄素与索拉非尼联合对人肾癌细胞株786-O增殖抑制作用的体外研究

赵建通张磊刘文瞻徐飞郭明涛路志民肖波

【摘要】目的研究姜黄素和索拉非尼联合应用对人肾癌786-O细胞株增殖的影响。方法采用MTT法观察姜黄素和索拉非尼对人肾癌细胞786-O细胞株的抑制作用。结果姜黄素及索拉非尼能抑制人肾癌786-O细胞株的增殖，并呈浓度及时间依赖性，两者作用人肾癌786-O细胞株48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为29.2 μmol/L、6.5 μmol/L。姜黄素6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L与索拉非尼1.5 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L、联合24 h、48 h、72 h的抑制率显著高于单用索拉非尼、姜黄素组(P＜0.05)。结论姜黄素在体外对人肾癌786-O细胞株的增殖有明显的抑制作用，能提高索拉非尼对人肾癌786-O细胞株的敏感性。

【关键词】姜黄素;索拉非尼;药物治疗;联合;786-O;肾癌

姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金和石菖蒲等中药中提取的一种天然酚性化合物［1］，具有广泛的药理作用，如抗炎［2］、抗氧化［3］、抗凝、抗病毒、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤［4］、抗突变等。近年来体外实验表明姜黄素能够抑制包括结肠癌［5］、前列腺癌［6］、肺癌［7］等在内多种肿瘤细胞增殖，并能诱导肿瘤细胞的凋亡。索拉非尼是Raf激酶和受体酪氨酸激酶抑制剂，体内外实验表明具有同时抑制肿瘤细胞增殖和血管生成的双重抗肿瘤作用［8］。目前作为晚期肾癌靶向用药已经投入临床应用。本研究首次探讨索拉非尼联合姜黄素对于人肾癌细胞786-O的体外抑制作用，证实两药联合具有协同作用，为进一步的体内试验与临床应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料人肾癌细胞786-O由中国科学院上海细胞研究所提供;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于美国Sigma公司; RPMI1640培养基购于美国GIBCO公司;胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司;索拉非尼由德国拜耳公司惠赠;姜黄素购于成都思科华生物技术有限公司，用DMSO溶解，－20℃保存，临用前解冻，用RPMI1640培养基稀释到所需浓度，使DMSO的终浓度＜0.1%。

1.2方法

1.2.1细胞培养:人肾癌786-O细胞接种于25 ml培养瓶中，培养基为含10%的胎牛血清、含青霉素100 U/ml，含链霉素100 U/ml RPMI1640，置入37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱孵育，待细胞长满培养瓶的80%，用胰酶进行消化、计数、传代。

1.2.2MTT法观察姜黄素与索拉非尼单药对细胞增殖的影响: 0.25%的胰蛋白酶消化对数期生长的细胞，悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，调整细胞浓度为1.0×105/ml，接种于96孔培养板，每孔100 μl，培养24 h后，分别加入含有不同浓度姜黄素、索拉非尼的RPMI1640培养液80 μl，使姜黄素的终浓度为6.25、12.5、25、50 μmol/L，索拉非尼的终浓度设为1.5、3、6、12 μmol/L。同时设阴性对照组、空白对照组，阴性对照组为只加RPMI1640培养液，空白对照组为不加细胞而只加培养基，每组设5个复孔，培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，继续培养4 h后，吸去上清液，加入150 μl的DMSO液，振荡培养板10 min，用酶标仪检测OD值，检测波长为490 nm。

1.2.3细胞增殖抑制率的计算:细胞增殖抑制率(%)=［1－(实验组OD值－空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值－空白对照组OD值)］×100%。

1.2.4姜黄素与索拉非尼联合对人肾癌786-O细胞增殖的影响:方法同上，取索拉非尼的终浓度为3 μg/ml、6 μg/ml分别与姜黄素6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L联合观察对人肾癌786-O细胞增殖的抑制作用。药物的合用效果［7］按下公式推测: q=E(AB)/EA+ (1－EA)×EB，其中E(AB)为两药合用的抑制率，EA、EB分别为单独用药的抑制率，若q值在0.85～1.15范围内表示两药作用相加，q值＞1.15表明两药作用协同，q值＜0.85则表示两药合用有拮抗作用。

1.3统计学分析应用SPSS 19.0统计软件，计量资料以±s表示，采用方差分析及t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1姜黄素对人肾癌786-O细胞增殖的抑制作用姜黄素对人肾癌786-O细胞的抑制作用，随着药物浓度的增加，时间的延长，其抑制作用增强，各药物浓度组与6.25 μmol/L组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，其作用24、48、72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为38.7 μmol/L、29.2 μmol/L、21.8 μmol/L。见表1。

表1　姜黄素对786-O细胞的增殖抑制作用　s

表1　姜黄素对786-O细胞的增殖抑制作用　s

注:与6.25 μmol/L比较，*P＜0.01

组别(μmol/L)　24 h　CI(%)48 h　72 h 6.25　8.1±0.7　9.4±0.8　13.1±0.5 12.5　19.3±4.2*　26.3±0.5*　27.7±0.5*25　35.9±1.3*　43.1±2.0*　52.6±3.9*50　58.0±0.8*　67.7±0.9*　75.3±0.5*

2.2索拉非尼对人肾癌786-O细胞的抑制作用索拉非尼对人肾癌786-O细胞增殖的抑制作用，随着药物浓度的增加，时间的延长，其抑制作用增强，各药物浓度组与1.5 μmol/L组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，其作用24、48、72 h的半数抑制浓度(IC50)为7.7 μmol/L、6.5 μmol/L、5.1 μmol/L。见表2。

表2　索拉非尼对786-O细胞增殖抑制作用　±s

表2　索拉非尼对786-O细胞增殖抑制作用　±s

注:与1.5 μmol/L比较，*P＜0.01

组别(μmol/L)　24 h　CI(%)48 h　72 h 1.5　7.3±0.6　9.2±0.4　14.3±0.5 3 20.7±0.3*　26.8±0.6*　30.6±0.8*6 40.7±0.7*　48.1±2.1*　53.5±0.3*12　65.6±0.7*　69.7±1.7*　79.9±0.5*

2.3索拉非尼与姜黄素联合对人肾癌细胞786-O的抑制作用索拉非尼6.0 μmol/ml与不同浓度的姜黄素联合对肾癌786-O细胞的增殖有明显的抑制作用，随着时间的延长，姜黄素剂量的增加，两者联合抑瘤作用呈增强的趋势(P＜0.01)，姜黄素12.5 μmol/L与索拉非尼联用对肾癌786-O细胞有明显的抑制作用，且随时间的延长，索拉非尼剂量的增加，两者联合抑瘤作用呈增强的趋势(P＜0.01)，两者联用强于单独应用姜黄素、索拉非尼组(P＜0.05)，按照两药合用效果公式推算，索拉非尼与姜黄素联合q值在0.85～1.15，两者之间呈相加关系。见图1～4，表3。

图1　药物对786-O细胞增殖抑制作用(姜黄素12.5 μmol/L+索拉非尼3 μmol/L)

图2　药物对786-O细胞增殖抑制作用(姜黄素12.5 μmol/L+索拉非尼6 μmol/L)

图3　药物对786-O细胞增殖抑制作用(姜黄素25 μmol/L+索拉非尼3 μmol/L)

图4　药物对786-O细胞增殖抑制作用(姜黄素25 μmol/L+索拉非尼6 μmol/L)

表3　应用MTT比色法分析姜黄素联合索拉非尼对786-O细胞增殖的影响(OD)　μmol/L，±s

表3　应用MTT比色法分析姜黄素联合索拉非尼对786-O细胞增殖的影响(OD)　μmol/L，±s

CMM+ SOR (μmol/L) CI (%) 24 h　q　48 h　q　72 h　q 12.5+12　75.4±0.6　1.04　87.1±0.7　1.12　94.7±0.61.09 12.5+6　51.5±0.5　0.99　68.2±0.7　1.10　74.3±0.9　1.12 12.5+3　32.3±0.4　0.90　45.6±0.8　0.99　54.3±0.9　1.09 12.5+1.5　23.2±0.7　0.92　32.1±0.7　0.97　39.3±0.6　1.03 25+12　85.1±0.5　1.09　93.5±1.2　1.12　97.8±0.9　1.08 25+6　66.3±0.7　1.07　78.9±0.7　1.10　87.2±0.6　1.12 25+3　51.7±1.0　1.05　65.7±0.6　1.10　74.2±0.6　1.11 25+1.5　40.2±0.8　0.99　50.3±0.9　1.00　59.7±0.8　1.01

3　讨论

肾癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，占全身恶性肿瘤的2%～3%，目前其发病率和病死率在世界范围内呈上升趋势，年均增长2%［9］。肾癌早期无明显临床症状，若出现“三联征”(血尿、疼痛和肿块)多为晚期。目前，外科手术仍是治疗肾癌唯一有效的治疗方法，但局限性病变仅占54%，65%的患者可出现复发或转移。多年以来免疫疗法一直是晚期肾癌唯一的治疗选择，但免疫治疗疗效较差，且毒副作用明显，仅有一小部分人受益。近年来靶向药物的发展，为晚期肾癌患者带来新的希望。Ⅱ期、Ⅲ期临床试验已证实，应用索拉非尼后患者肿瘤体积会明显减小，无进展生存期较安慰剂组均可见明显延长［10，11］。

随着这些多靶向药物的应用也暴露出一些问题，如长期应用费用较高，易产生耐药性，故寻找高效低毒的肿瘤靶向治疗增敏剂，以增强索拉非尼，索坦的靶向治疗效果，降低治疗费用，提高患者的生存时间仍是我们需要亟待解决的问题。

姜黄素是从中药姜科姜黄属植物中提取的一种酚类化合物，有多种药理作用，近年来其抗肿瘤作用受到了人们的关注，美国国家肿瘤研究所已将其列为第三代癌化学预防药，大量研究表明其抗肿瘤活性与下列因素有关: (1)抑制癌基因的表达促使抑癌基因的表达; (2)诱导肿瘤细胞凋亡; (3)诱导肿瘤细胞分化; (4)抑制金属基质蛋白酶及肿瘤血管生成; (5)抑制COX-2和iNOS的活性; (6)抑制与肿瘤细胞增殖有关的多种蛋白激酶的活性; (7)抑制AP-1及NF-κB的活性; (8)抗氧化损伤［11－13］。研究表明，姜黄素不仅可以促进血液系统恶性肿瘤细胞(如急性髓性白血病细胞)的凋亡［12］，还能够促进实体肿瘤癌细胞的凋亡，如:乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和BT-474和鼻咽癌细胞系NPC1和NPC2等［13－15］。

姜黄素与索拉非尼联合对人肾癌786-O细胞增殖的影响目前尚未见报道，我们的实验发现姜黄素与索拉非尼均能显著抑制786-O细胞的生长，并呈时间、剂量依赖性，它们作用48 h的IC50分别为29.2 μmol/L 和6.5 μmol/ml，按药物合用效果公式［16］推算出索拉非尼与姜黄素两者联合其q值在0.85～1.15，呈现出相加的抑瘤作用，姜黄素12.5 μmol/L、25 μmol/L与索拉非尼3 μmol/L、6 μmol/L联用，其24、48、72 h对增殖抑制率要明显强于单独使用索拉非尼或姜黄素组(P＜0.05)，联合抗瘤效果更加明显，而姜黄素6.25 μmol/L、与索拉非尼3 μmol/L、6 μmol/L联合作用786-O细胞24 h、48 h，联合相加的抗瘤作用不够显著，提示姜黄素与索拉非尼联合使用时，要选择较高的药物浓度，以达到最佳抗肿瘤效果，同时我们也发现在索拉非尼浓度确定的情况下，随着姜黄素浓度的增加，时间的延长，两者联合抑制人肾癌786-O细胞增殖效果也增强。有文献报道姜黄素与DDP［17］、5-Fu［18］、NVB［19］、紫杉醇［20］联合使用呈现出增强抑瘤效果。我们的实验得出姜黄素与索拉非尼联合应用呈现出明显增强的抑瘤效果。这也说明无明显不良反应的姜黄素与多种药物联合有着增强的抑瘤效果，在肿瘤的治疗中有着良好的应用前景。

综上所述，姜黄素与索拉非尼联用对人肾癌786-O细胞的增殖呈现出相加的抑制作用，姜黄素在12.5 μmol/L以上的浓度能增强索拉非尼对肾癌786-O细胞的敏感性，提示姜黄素与索拉非尼联合使用在肾肿瘤的治疗中有良好的应用价值，但由于我们所做的是体外细胞学实验，与体内药物学实验有一定的差距，尚需临床上进一步研究证实。

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·论著·

Study on the inhibitory effects of curcumin combined with sorafenib on the proliferation of human renal carcinomacell line-786-O in vitro

ZHAO Jiantong*，ZHANG Lei，LIU Wenzhan*，et al.*
The First Department of Urology，The First Hospital of Handan City，Hebei，Handan 056000，China

【Abstract】Objective To explore the effects of curcumin combined with sorafenib on the proliferation of human renal carcinoma cell line-786-O in vitro.Methods The inhibitory effects of curcumin and sorafenib on growth of renal carcinoma cell line－786-O were detected by MTT.ResultsThe curcumin and sorafenib inhibited the proliferation of human renal carcinoma cell line－786-O in a concentration and time-dependent manner，their IC50 was 29.2μmol/L，6.5μmol/ml on 48 hours，respectively.The combined inhibitory effects of curcumin at concentration of 6.25μmol/L，12.5μmol/L，25μmol/L，50μmol/L and sorafenib at concentration of 1.5μmol/L，3μmol/L，6μmol/L，12μmol/L for 24h，48h，72h were significantly higher than those of single application of curcumin or single application of sorafenib (P＜0.05).Conclusion Curcumin can significantly inbibit the growth of 786-O cells，which can increase the sensitivity of 786-O cells to sorafenib.

【Key words】curcumin; sorafenib; drug therapy; combination;786-O; renal cancer

(收稿日期:2015－08－20)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2016.04.004

【中图分类号】R 737.11

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2016) 04－0495－04

作者单位: 056000河北省邯郸市第一医院泌尿一科(赵建通、刘文瞻、徐飞、郭明涛、路志民、肖波) ;河北医科大学基础学院(张磊)