缺氧条件下肝癌细胞和正常肝细胞能量代谢通路的差异

李澎瀛　张东阳　吴美玲　董克磊　施冬云

(复旦大学基础医学院生物化学与分子生物学系　上海　200032)



缺氧条件下肝癌细胞和正常肝细胞能量代谢通路的差异

李澎瀛张东阳吴美玲董克磊施冬云△

(复旦大学基础医学院生物化学与分子生物学系上海200032)

【摘要】目的比较缺氧条件下肝癌细胞与正常肝细胞能量代谢通路的差异,探索肿瘤细胞的耐缺氧机制。方法采用环境缺氧(0.2%O2缺氧培养箱)模拟肿瘤的体内环境,比较肝癌细胞株HepG2与原代分离的小鼠肝脏细胞在不同缺氧时间下的能量代谢情况。流式细胞术检测各组活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,MTT法检测各组细胞缺氧后细胞活力及生存率,real-time PCR方法检测己糖激酶2(hexokinase 2)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase)等糖代谢关键酶及p53、TIGAR/Tigar、SCO2/Sco2基因的mRNA水平,NADH比色法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)活性,氧电极法检测各组细胞耗氧量,高效液相色谱法检测细胞内ATP含量。结果缺氧后,肿瘤细胞HepG2与正常小鼠肝脏细胞相比生存率更高,活性氧增幅更小。两种细胞在缺氧下耗氧量都下降,但肝癌细胞的ATP产量代偿性增加,而正常肝细胞的ATP显著下降;有氧氧化相关酶基因在缺氧小鼠肝脏细胞中代偿性上调,而在缺氧HepG2细胞中下降;糖酵解相关酶基因在缺氧HepG2细胞中上调更迅速,幅度更大;进一步研究表明,缺氧时,小鼠肝脏细胞p53、Tigar、Sco2基因表达上调,而HepG2细胞p53、TIGAR、SCO2基因表达下调。结论在缺氧应激状态下,正常细胞主要依赖有氧氧化补偿能量,肿瘤细胞则主要依赖糖酵解。ROS或可通过调节肿瘤细胞p53/TIGAR、p53/SCO2通路及糖酵解关键酶活性促进Warburg效应与肿瘤耐缺氧能力。

【关键词】肿瘤缺氧;能量代谢通路;活性氧;Warburg效应;小鼠

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31270901,30970684).

新生血管畸变导致血液供应不足,肿瘤与周边正常组织最大的差别就是肿瘤内部的缺氧微环境。不同于正常组织,肿瘤在氧气及养分不足的环境中仍得以存活生长,并获得抗药性。大量研究已证实,肿瘤部分区域极低浓度的氧气反而会增加肿瘤的侵袭性行为和显示更差的预后[1]。肿瘤细胞对缺氧的强耐受力被认为是肿瘤发展、侵袭、转移的重要因素[2]。缺氧对组织细胞带来的危害主要包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量增加以及氧气不足造成的能量耗竭[3]。因此,缺氧肿瘤细胞维持自身代谢活动的方式便是研究肿瘤缺氧耐受能力的关键。

Warburg效应揭示了肿瘤细胞有氧糖酵解的独特能量代谢方式。我们以前的研究发现[4-5],缺氧和活性氧可以上调细胞内的糖酵解通路,Warburg效应可能与氧化应激微环境相关。然而,肿瘤细胞究竟如何利用低效率的糖酵解满足其体内快速生长所需要的能量需求,其机制尚不清楚。

p53在代谢通路调控中起重要作用。p53可转录激活Tigar蛋白,后者通过降解细胞内2,6-二磷酸果糖抑制糖酵解,使葡萄糖通量涌入PPP通路[4-6]。p53还可上调呼吸链复合物Ⅳ中的细胞色素C氧化酶组装蛋白2(cytochrome C oxidase assembly protein,SCO2)[7],从而促进氧化磷酸化。我们推测缺氧肿瘤细胞可能通过p53/TIGAR和p53/SCO2通路调控缺氧肿瘤能量代谢。

本文采用环境缺氧方式(0.2% O2缺氧培养箱)模拟肿瘤内部的缺氧环境,比较肿瘤细胞与正常细胞在糖酵解、有氧氧化、能量生成、p53及其下游信号等方面的变化,探讨肿瘤细胞缺氧耐受的产生机制,为肿瘤的靶向治疗提供新的思路。

材 料 和 方 法

实验动物、细胞株与仪器SPF级昆明小鼠购自复旦大学实验动物科学部[生产许可证号：SCXK(沪) 2014-0004];人肝癌细胞株HepG2购自ATCC细胞库;三气培养箱(德国Binder CB系列);CO2细胞培养箱(美国Thermo Forma公司);液相氧电极(Oxygraph,英国Hansatech公司);高效液相色谱HPLC系统(日本岛津公司);高效液相色谱柱[ODS-SPC18(4.6 mm×250 mm,粒径5 μm),日本岛津公司];荧光定量PCR仪(7900HT,美国ABI公司);流式细胞仪(FC500,美国Beckman Coulter公司)。

小鼠肝脏细胞原代分离小鼠麻醉后剖开腹腔,暴露门静脉并插入塑料导管,灌注37 ℃的Hanks平衡盐溶液5～10 min以除去肝内血液。结扎下腔静脉,并插入另一根塑料导管,同时结扎胸腔段静脉。灌注37℃胶原酶消化液(Ⅳ型胶原酶,0.05%),待整肝鼓胀泛白后,撕去表面包膜并将肝细胞转移至DMEM培养液(含10%FBS,105U/L青霉素与链霉素)。细胞悬液经200目不锈钢滤网除去细胞团块,并以上述DMEM培养液洗涤3次,低速离心(1 000 r/min,离心半径为13 cm,5 min)收取纯化肝细胞并接种于无菌细胞培养皿。接种4 h后更换细胞培养液。

细胞培养与缺氧HepG2细胞株在含有10% FBS DMEM培养液(含青霉素和链霉素各100 U/mL)中,于37 ℃、5% CO2条件下培养至贴壁面积达80%以上。使用含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化后,按1∶2或1∶4比例传代,贴壁4～6 h后备用。原代小鼠肝脏细胞自分离接种4 h后备用。将已贴壁细胞转移放入常规细胞培养箱继续培养24 h,作为缺氧0 h对照组;先于常规培养箱中继续培养18 h,再转入37℃、0.2% O2缺氧培养箱中培养6 h,作为缺氧6 h组;先于常规培养箱中继续培养12 h,再转入37℃、0.2% O2缺氧培养箱中培养12 h,作为缺氧12 h组;直接转入37 ℃、0.2% O2缺氧培养箱中继续培养24 h,作为缺氧24 h组。

MTT法检测细胞活力取对数生长期细胞接种于96孔培养板,每孔200 μL细胞悬液(5×103细胞)。培养4～6 h待细胞贴壁后,每组设置至少3个平行孔。于培养常氧培养箱与缺氧培养箱中各培养24、48、72 h。达到缺氧时间后,迅速向各孔加入20 μL (5 mg/mL)MTT溶液,37 ℃孵育4 h后吸去各孔内溶液,加入150 μL DMSO,置摇床上低速震荡10 min,待结晶充分溶解后,以DMSO调零,用多功能酶标仪检测仪在490 nm处测定各孔吸光度D,并计算细胞存活率(survival rate,SR)。SR =实验组D490/对照组D490×100%。

高效液相色谱(HPLC)检测ATP含量细胞ATP样品收集及HPLC检测方法参考Zur等[8]的研究。

荧光定量PCR检测胞内目的基因mRNA表达水平用冰冷PBS清洗细胞,按105～106细胞/mL加入Trizol试剂充分吹打,静置10 min后转入 1.5 mL离心管;加入200 μL氯仿,涡旋混匀,室温静置10 min;12 000 ×g 4 ℃离心15 min,上清(约500 μL)转移至另一离心管;加500 μL异丙醇,震荡混匀,室温静置10 min;12 000×g 4 ℃离心15 min,可见RNA絮状沉淀,将上清小心弃去,并加入500 μL预冷的75%乙醇洗涤RNA沉淀1次,弃去乙醇,适度挥发后,用DEPC处理水溶解RNA,检测RNA浓度并调整为2 μg /10 μL,置冰上备用。逆转录PCR体系按照DBI公司RT-PCR试剂盒(DBI-2226)说明书进行,反转录cDNA储备液稀释适当倍数后,按DBI公司荧光定量PCR试剂盒(DBI-2043)说明书配置荧光定量PCR体系并进行荧光定量PCR。

流式细胞术检测细胞ROS水平细胞接种于6孔板,培养完成后,弃培养液,PBS清洗1次后弃尽,每孔加1 mL DCF工作液(10 μmol/L),铺匀后避光37 ℃孵育20 min,后续步骤避光操作。洗弃DCF工作液,用PBS清洗细胞表面3次,胰酶消化收集细胞于500 μL PBS,冰浴送检。设置流式细胞仪激发波长为488 nm,发射波长为525 nm,检测各样品的平均荧光强度,作为ROS水平的度量。

细胞耗氧量检测设定氧电极温度37 ℃,于检测小室中加入2 mL纯净水并持续搅拌至温度恒定且氧气饱和。吸出检测室内纯净水,加入2 mL细胞培养液搅拌至信号平衡,记录培养液起始氧浓度。向检测小室内注入100 μL样品细胞悬液(含105细胞),并立即计时5 min,记录溶解氧变化。

统计学分析所有数据使用SPSS 13.0统计软件进行分析,采用Student’st检测或One-way Anova方法进行检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

缺氧条件下肝癌细胞和正常肝细胞ROS水平及生存的差异随缺氧时间延长,肝癌细胞与正常肝细胞的ROS水平均逐步提高,但正常细胞增加得更快,增幅更大。缺氧24 h组小鼠肝脏细胞的ROS水平是缺氧0 h组小鼠肝脏细胞的4倍,而缺氧24 h组HepG2细胞的ROS水平则仅为缺氧0 h组HepG2细胞的1.8倍。在此过程中,HepG2细胞各组的ROS水平始终高于同条件下的正常细胞组(图1A)。缺氧条件下,两种细胞的存活率都随缺氧时间延长而减少,但小鼠肝脏细胞下降幅度更大,缺氧24 h组小鼠肝脏细胞的生存率已降至40%以下,而缺氧24h组HepG2细胞的生存率仍维持在80%左右,说明肿瘤细胞具有较强的缺氧耐受能力(图1B)。

缺氧条件下肝癌细胞和正常肝细胞在糖酵解通路相关基因的差异如图2A所示,两种细胞己糖激酶基因的水平在缺氧6 h、12 h时都代偿升高,而在24 h则呈下降趋势。图2B表示,缺氧后HepG2细胞丙酮酸脱氢酶基因PKM2的水平比较稳定,缺氧24 h组HepG2细胞的PKM2表达与其缺氧0 h组差异无统计学意义(P>0.05),而缺氧24 h组小鼠肝脏细胞PKM2基因的表达与其缺氧0 h组相比则显著降低(P<0.05)。如图2C所示,缺氧后小鼠肝脏细胞及HepG2细胞LDH活力均随缺氧时间延长而增加,且HepG2细胞增加更为迅速,涨幅更大。缺氧24 h组小鼠肝脏细胞的LDH活性是0 h组的10倍,而缺氧24 h组HepG2细胞的LDH活性则为0 h组的22倍以上。这些结果都说明在缺氧的情况下,相对于正常细胞,肿瘤细胞更倾向于通过糖酵解通路相关酶的表达或活性代偿升高来补偿能量供应的不足。

The introcellular ROS level(A) and survival curve (B) of mice hepatocellular and HepG2 under hypoxia. Cell viability (%control) represents the ratio of hypoxic cell viability to nomoxic cell viability being cultured for the same time.(1)vs. hepatocytes 0 h group,P<0.05;(2)vs. HepG2 0 h group,P<0.05 (n≥3).

图1缺氧小鼠肝脏细胞与HepG2细胞的生存曲线与胞内ROS水平

Fig 1Survival rate and ROS level of mice hepatocytes and HepG2 cells under hypoxia

(1)vs. hepatocytes 0 h group,P<0.05;(2)vs. HepG2 0 h group,P<0.05 (n≥3).

图2缺氧小鼠肝脏细胞与HepG2细胞的糖酵解水平

Fig 2The glycolysis level of mice hepatocytes and HepG2 cells under hypoxia

缺氧条件下肝癌细胞和正常肝细胞在有氧氧化通路相关基因的差异如图3A所示,两种细胞异柠檬酸脱氢酶的基因水平在缺氧6 h时都呈现代偿升高然后下降的趋势。在缺氧12 h时,小鼠肝脏细胞Idh表达虽有回落,但仍与缺氧0 h对照组持平(P>0.05),而相同缺氧时长的HepG2细胞已经显著低于其0 h对照组(P<0.05)。如图3B所示,与IDH的基因表达相似,缺氧后HepG2琥珀酸脱氢酶SDH基因表达水平随缺氧时间迅速下降,缺氧6 h组差异已出现统计学意义(P<0.05,vs. HepG2缺氧0 h组),而小鼠肝脏细胞Sdh表达水平直到缺氧12 h依然处于代偿性升高,与其缺氧0 h组差异无统计学意义(P>0.05)。进一步说明在缺氧的情况下,正常细胞比肿瘤细胞更依赖于有氧氧化通路。此结果说明与肿瘤细胞不同,正常细胞在缺氧的情况下主要依靠有氧氧化通路代偿性升高来补偿能量供应的不足。

缺氧条件下肝癌细胞和正常肝细胞在耗氧率与ATP生成的差异如图4A所示,随缺氧时间的延长,两种细胞的耗氧率都显著降低(P<0.05),但HepG2细胞的耗氧率始终显著高于小鼠肝脏细胞,说明在缺氧的情况下,肿瘤细胞消耗的氧气仍比正常细胞多。 如图4B所示,两种细胞在缺氧时ATP生成量的变化截然相反。缺氧后,HepG2细胞的ATP的生成代偿性升高,直至24 h依然不低于其缺氧0 h组(P>0.05)。而小鼠肝脏细胞ATP含量则随缺氧时间迅速下降。说明在缺氧的情况下,肿瘤细胞依然能产生足够的ATP,而正常细胞则可能已经处于ATP匮乏的状态。缺氧24 h内,肿瘤细胞耗氧率的下降与ATP的增加,说明这部分增加的ATP可能主要来自于糖酵解。

(1)vs. hepatocytes 0 h group,P<0.05;(2)vs. HepG2 0 h group,P<0.05 (n≥3).

图3缺氧小鼠肝脏细胞与缺氧HepG2细胞的有氧氧化关键酶的基因表达

Fig 3The expression of key enzymes involved in aerobic oxidation in mice hepatocytes and HepG2 cells under hypoxia

The oxygen consumption rate (A) and ATP production of mice hepatocytes and HepG2 cells under hypoxia (B). All values were mean±SD.(1)vs. hepatocytes 0 h group,P<0.05;(2)vs. HepG2 0 h group,P<0.05 (n≥3);(3)vs. hepatocytes 6 h group,P<0.05;(4)vs. HepG2 6 h group,P<0.05 (n≥3).

图4缺氧小鼠肝脏细胞与缺氧HepG2细胞的能量代谢状态

Fig 4The energy metabolism state of mice hepatocytes and HepG2 cells under hypoxia

肿瘤细胞对缺氧耐受与p53、tigar及sco2基因表达相关如图5,小鼠肝脏细胞p53、tigar、sco2的基因mRNA水平在缺氧12 h后分别增长为缺氧0 h对照组的1.7倍、1.22倍与4.29倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。这3种基因在缺氧12 h组HepG2细胞内表达变化则截然相反。相比于缺氧0 h组,缺氧12 h组HepG2细胞p53、TIGAR、SCO2的基因mRNA水平分别降低了36%、63%和46%,差异具有统计学意义(P<0.05)。

讨论

肿瘤细胞生长增殖迅速,而血管生成相对滞后,且新生血管普遍存在异常,这种情况导致了肿瘤细胞大多数情况下处于缺氧及养分供应不足的微环境中。细胞在缺氧环境中会经历一系列生理变化,缺氧严重时则会引发凋亡。肿瘤细胞在衍变过程中产生了对缺氧微环境较强的耐受能力,使其不仅可以存活而且能维持一定程度的增殖,同时还伴随着恶化转移[1]及放化疗抗性,我们的实验结果也证实了肿瘤细胞具有更高的缺氧生存率(图1B)。因此,肿瘤细胞对于缺氧应激所做出的各种适应性应答将为有效的抗癌疗法提供靶点。本研究采用0.2%环境氧浓度对细胞进行缺氧处理。在该浓度下平衡的无细胞培养液溶解氧浓度为32 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa,下同),介于人体内正常组织氧分压60 mmHg与肿瘤内部氧分压15 mmHg之间[9-10]。

(1)vs. hepatocytes 0 h group,P<0.05;(2)vs. HepG2 0 h group,P<0.05 (n≥3).

图5缺氧小鼠肝脏细胞与缺氧HepG2细胞p53,TIGAR/Tigar及SCO2/Sco2基因表达

Fig 5The expression ofp53,TIGAR/TigarandSCO2/Sco2 in mice hepatocytes or HepG2 cells under hypoxia

缺氧对组织细胞带来的危害之一是氧气不足造成的能量耗竭[11]。ATP含量是细胞能量产出的直接指标,本研究通过对比肿瘤细胞与正常细胞在缺氧后ATP产量的变化,探究两者能量产出受缺氧环境的影响程度。研究结果表明(图4B),缺氧肿瘤细胞的能量耗竭速率要远低于正常细胞。相比于正常细胞迅速降低的ATP含量,肿瘤细胞ATP含量在短时间缺氧时甚至还出现一定程度的代偿性增加。细胞ATP产出来源于糖酵解通路及线粒体有氧氧化,1分子葡萄糖经由糖酵解通路分解为丙酮酸,产出2个ATP,丙酮酸在氧气充足的条件下进入线粒体继续氧化,此过程中可直接或间接地生成36个ATP。因此,线粒体有氧氧化是需氧生物能量产出的主要来源。然而,本研究发现正常细胞与肿瘤细胞在缺氧后耗氧量均受到抑制(图4A),而肿瘤细胞在耗氧量降低的同时ATP产出却是大幅增加的,说明肿瘤细胞通过线粒体有氧氧化以外的其他方式有效地补偿了线粒体能量产出的不足,即糖酵解通路,以此维持缺氧条件下自身的能量供应。

IDH与SDH是细胞参与有氧氧化的重要成员,前者参与三羧酸循环(TCA cycle),将NAD还原为NADH,SDH既是TCA循环成员,同时也是线粒体传递链的复合体2。本实验对比了缺氧后正常细胞与肿瘤细胞IDH/Idh与SDH/Sdh基因的表达,用以说明细胞内有氧氧化水平。结果表明(图3)缺氧后的正常细胞会通过提高有氧氧化相关基因的表达水平,来弥补氧气缺失所造成的能量产出不足,说明正常细胞在缺氧环境中仍然主要依靠有氧氧化功能。然而,这显然并不能长久维持,随着缺氧时间的延长,以氧气作为最终电子受体的呼吸链受阻,导致细胞能量耗竭而死亡。Warburg效应的提出揭示了肿瘤细胞不同于正常细胞的代谢方式,该假说认为,肿瘤细胞即便在氧气充足的条件下也依赖糖酵解供能的原因在于线粒体缺陷,说明肿瘤细胞已不以线粒体呼吸作为主要能量产出方式。本研究中,与正常小鼠肝脏细胞不同,肿瘤细胞HepG2在缺氧后IDH与SDH基因表达水平迅速下调。我们推测,缺氧肿瘤细胞有氧氧化相关酶的下调,使得TCA循环减慢,减少了TCA循环产物NADH对呼吸链的递氢量,不但降低了缺氧状态下细胞在有氧氧化通路上不必要的物料浪费,将葡萄糖更多地送入无氧糖酵解与磷酸戊糖通路(pentose phosphate pathway,PPP),同时也阻止了由于呼吸链受阻、电子溢出而导致的ROS大量增加,降低细胞缺氧损伤。本研究的结果也验证了这一观点,肿瘤细胞缺氧后ROS增幅小于正常细胞(图1A),两种细胞糖酵解相关酶HK2/Hk2、PKM2/Pkm2基因表达水平均上调,但肿瘤细胞上调幅度更大(图2A、2B),其无氧糖酵解末端酶LDH活性也大幅上调,增幅远高于正常细胞(图2C)。这些结果说明,缺氧条件下正常细胞仍依赖有氧氧化代偿增加补充能量,而肿瘤细胞则依赖迅速高度活化的无氧糖酵解。

我们以前的研究表明[12],缺氧可诱导ROS释放,并可通过缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1)上调细胞内的糖酵解通路,说明肿瘤Warburg效应可能与其缺氧氧化应激微环境相关。此外,ROS也被发现可通过调节p53基因影响细胞生长。p53是一种重要的肿瘤抑制基因,且有超过半数以上的恶性肿瘤被发现存在p53突变,失去了对细胞生长凋亡的调控作用[13-14]。 但近年来发现p53可以通过诱导TIGAR降解2,6-二磷酸果糖从而抑制糖酵解,并可活化SCO2提升有氧氧化,在肿瘤能量代谢中起重要调控作用[15-16]。本研究对比了缺氧后肿瘤细胞与正常细胞P53/p53、TIGAR/Tigar及SCO2/Sco2的mRNA表达量(图5),结果与设想一致,正常细胞缺氧12 h后p53基因表达上调,Tigar基因表达也随之上调,提示正常细胞缺氧后糖酵解通路可能因2,6-二磷酸果糖的降解而受到抑制。由于2,6-二磷酸果糖处于己糖激酶的下游,故Tigar表达上调并不会影响Hk2的基因表达,且Tigar与Hk2表达共同上调可进一步促进葡萄糖通量涌入PPP通路。因此,正常细胞缺氧己糖激酶基因表达代偿性增加并非主要用于补充能量,而是用于促进PPP通路产生更多的NADPH以对抗缺氧产生的ROS。但此代偿作用并不持久,缺氧24 h后,正常细胞Hh2与其Pkm2基因表达一样,受到了显著抑制。此外,缺氧12 h后正常细胞Sco2的mRNA水平大幅提升,这与正常细胞缺氧后Idh、Sdh基因表达代偿性增加的结果一致,说明正常细胞缺氧后通过有氧氧化代偿补充能量。与正常细胞不同,本研究中肿瘤细胞p53、TIGAR、SCO2基因均降低。Tigar基因的降低稳定了2,6-二磷酸果糖对糖酵解通路的促进作用,处于下游的PKM2基因表达稳定(图2B),LDH活性大幅增加(图2C),说明缺氧肿瘤细胞极大地增加提高了无氧糖酵解水平,原本进入线粒体继续氧化的丙酮酸转而大量生成乳酸。此过程虽然产能低效,却很大程度上通过降低有氧氧化及NADH生成,阻止NADH在缺氧的环境下向线粒体持续递氢,防止电子传递链由于电子终受体氧分子不足而大量溢出,保护线粒体不受电子溢出所产生的ROS损伤,抑制线粒体介导的细胞凋亡。本研究中,相对于正常细胞,肿瘤细胞的ROS水平在缺氧后更为稳定也进一步证实了此观点(图1A)。即便如此,肿瘤细胞的ROS水平始终是高于正常细胞的,暗示了ROS在肿瘤细胞中的重要作用。结合ROS对p53、HIF-1等基因的多重调控作用,以及我们早期对ROS调控p53基因表达的研究[17],仍可认为肿瘤细胞所维持的一定量ROS参与调控了肿瘤细胞缺氧能量代谢及缺氧耐受。

本研究发现在缺氧应激状态下,细胞可通过代偿性提高能量代谢通路来补偿能量供应,正常细胞主要依赖有氧氧化补偿能量,而肿瘤细胞则主要依赖糖酵解。缺氧肿瘤细胞独特的能量代谢方式可能归因于ROS参与调控的p53/TIGAR及p53/SCO2通路,这不仅可维持其能量供应,还降低了缺氧应激对线粒体的损伤,抑制线粒体介导的细胞凋亡(图6)。这一发现为肿瘤细胞缺氧耐受能力提供了理论基础,并一定程度上解释了肿瘤Warburg效应,为肿瘤的靶向治疗提供了思路,但ROS参与肿瘤细胞缺氧能量调节及缺氧耐受能力形成的具体方式、作用节点等问题,仍需进一步研究和探讨。

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The difference of energy metabolism pathways between normalhepatocytes and hepatoma cells under hypoxia

LI Peng-ying, ZHANG Dong-yang, WU Mei-ling, DONG Ke-lei, SHI Dong-yun△

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo compare the difference between energy metabolism pathways of hypoxic normal hepatocytes cells and tumor cells, and try to understand the underlying mechanism of tumor hypoxia resistance.MethodsWe adopted environmental hypoxia (Hypoxia incubator with 0.2%O2) to mimic the tumor environment in vitro,and compared the difference of energy metabolism response to hypoxic stress between HepG2 cells and mice hepatocytes.Flow cytometry was used to detect the level of different kinds of ROS.MTT was used to compare the viability of cells before and afterhypoxia.The mRNA level of p53,Tigar,SCO2, and key enzymes in the metabolism including hexokinase 2 and isocitrate dehydrogenase,were detected by real-time PCR.NADH colorimetric assay was used to detect lactate dehydrogenase activity.Oxygen electrode was used to detect the oxygen consumption rate of cells.HPLC was used to detect the ATP levels in cells.ResultsUnder moderate hypoxia, HepG2 cells had a higher survival rate and underwent a more steady reactive oxygen species (ROS) fluctuation. The oxygen consumption rate declined in both types of cells, ATP production in hepatoma cells increased with cellular proliferation being maintained,but decreased significantly in normal liver cells. The results also showed that key enzymes involved in aerobic oxidation were compensatively increased in normal liver cells but decreased in hepatoma cells under hypoxia. The key enzymes involved in glycolysis were both upregulated in response to hypoxia, but the hepatoma cells increased more significantly. Further studies showed that in response to hypoxia, the mRNA expression of p53,Tigar and Sco2 were all upregulated in normal liver cells but p53,TIGAR and SCO2 downregulated in hepatoma cells.ConclusionsUnder hypoxia stress, normal cells mainly depend on aerobic oxidation to compensate the energy, but hepatoma cells mainly rely on glycolysis. ROS may enhance glycolysis through p53/TIGAR and p53/SCO2 pathways, so as to promote the Warburg effect and hypoxia tolerance.

【Key words】tumor hypoxia;energy metabolism pathway;reactive oxygen species;Warburg effect;mouse

(收稿日期:2015-11-24;编辑:王蔚)

【中图分类号】R730

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.001

国家自然科学基金(31270901, 30970684)

△Corresponding authorE-mail:dyshi@fudan.edu.cn