液相色谱-质谱联用法测定罗库溴铵血药浓度

蒋果廷　王婷婷　孙　申　郁韵秋△

(1复旦大学药学院药物分析教研室　上海　201203;2复旦大学附属妇产科医院麻醉科　上海　200090)



液相色谱-质谱联用法测定罗库溴铵血药浓度

蒋果廷1王婷婷2孙申2郁韵秋1△

(1复旦大学药学院药物分析教研室上海201203;2复旦大学附属妇产科医院麻醉科上海200090)

【摘要】目的建立液相色谱-质谱联用 (liquid chromatography-tandem mass spectrum,LC-MS)方法测定血浆中罗库溴铵浓度,并对静脉注射0.9 mg/kg该药物的患者2 h内的血药浓度进行测定。方法血浆中加入内标盐酸维拉帕米后用乙腈沉淀蛋白法进行处理,离心后取上清进样。选用Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱分离,流动相为乙腈-甲酸铵 (60∶40，5 mmol/L,pH=5.5),流速1 mL/min,柱后三通分流,0.2 mL/min流量进入质谱。质谱采用电喷雾 (electrospray ionization,ESI)接口,选用正离子模式,检测方式为选择性离子监测 (selected ion monitor,SIM)模式。结果罗库溴铵在0.1～10 μg/mL范围内呈良好的线性关系,精密度及稳定性均符合生物样本测定要求。结论LC-MS是一种简单、快速、准确测定罗库溴铵血药浓度的方法,并成功应用于静注2 h内临床样本的测定。

【关键词】罗库溴铵;液相色谱-质谱联用;静脉注射;选择性离子监测

罗库溴铵 (Rocuronium bromide)是一种甾类非去极化肌肉松弛剂,为季铵盐结构，于1989年首次被报道[1],验证其安全性和有效性后,于1994年在美国及英国上市,并于2000年以“爱可松”为商品名进入中国市场。相对于其他肌松药,罗库溴铵具有起效快、代谢产物少的优点,其主要经过肝脏代谢,胆道排除,经肾排泄只占次要地位[2-3],临床用于开腹手术及腹腔镜手术麻醉。

文献中测定罗库溴铵血药浓度主要采用液质联用的方法,前处理采用二氯甲烷提取法[4-5]或固相微萃取[6]等,过程较为复杂费时,给快速高通量检测带来困难，因此需要一种更为简便可靠的测定方法来实现临床监测。考虑到相关手术在2 h之内即可完成,手术过程实时监测，无需非常低的定量限,本课题预处理采用一步蛋白沉淀方法，简化了实验流程，并按照2015版《中国药典》中《9012 生物样品定量分析方法验证指导原则》验证了该分析方法，最终成功应用于临床样本(复旦大学附属妇产科医院麻醉科提供)的测定。本文建立了一种准确、可靠、方便的LC-MS法测定罗库溴铵的血药浓度,为治疗药物临床检测提供了依据。

材 料 和 方 法

仪器1260型高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司)包括G1311B型Quat Pump四元泵、G1329B型ALS自动进样器、AT330型色谱柱恒温箱和OpenLAB CDS ChemStation Edition工作站,6120型四级杆质谱检测器；TGL-16G型离心机(上海安亭科学仪器T)；GB204型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ER-182A型电子天平(日本A&D公司)。

试剂罗库溴铵 (浙江仙琚制药股份有限公司)，盐酸维拉帕米 (99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，甲醇 (HPLC级,国药集团化学试剂有限公司)，乙腈 (HPLC级,美国Biologic-Reagents公司)，甲酸 (HPLC级,美国Dikma Technologies公司)，甲酸铵 (98%,美国Anaqua Chemicals Supply公司)。

储备液的配制GB204天平(万分之一天平)精密称取罗库溴铵0.020 0 g,乙腈溶解并于100 mL容量瓶中定容,配成200 μg/mL储备液;ER-182A天平(十万分之一天平)精密称取内标盐酸维拉帕米0.002 50 g,甲醇溶解并于50 mL容量瓶中定容,配成50 μg/mL储备液,均于4 ℃条件下储存,临用时稀释至所需浓度。

工作液的配制取内标储备液室温放置,用乙腈稀释到10 μg/mL。取罗库溴铵储备液室温放置,用乙腈逐级稀释得一系列标准溶液,浓度分别为200、150、100、40、20、10、4及2 μg/mL。再与浓度为10 μg/mL的内标溶液等体积混合,得到浓度为100、75、50、20、10、5、2及1 μg/mL的工作液 (含内标5 μg/mL),供标准血样配制用。

标准血样的配制取人空白血浆90 μL与上述方法配制的工作液10 μL混合,涡旋3 min。制得标准曲线样品,浓度为10、5、2、1、0.5、0.2及0.1 μg/mL (含内标0.5 μg/mL),质控样品浓度为7.5、1、0.2及0.1 μg/mL (含内标0.5 μg/mL)。

临床样本加内标向90 μL临床样本中加入10 μL浓度为5 μg/mL的内标溶液,涡旋3 min,制得含内标0.5 μg/mL的临床血样。

血浆样品前处理向100 μL含内标血样中加入300 μL乙腈,涡旋1 min,静置5 min,之后采用6 640×g转速离心10 min,取上清进样。

液相色谱条件色谱柱:Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm);预柱:Phenomenex C18 (4 mm×3.0 mm);流动相:乙腈:甲酸铵 (5 mmol/L,pH=5.5,60∶40);流速:1 mL/min,三通柱后分流0.2 mL/min进质谱;柱温:40 ℃;进样体积:5 μL;洗针溶液:60%乙腈水溶液。

质谱条件离子源:电喷雾接口 (electrospray ionization,ESI),正离子模式;干燥气流速:12 mL/min;干燥气温度:350 ℃;雾化器电压:35 psi;质谱检测器:选择性离子监测 (selected ion monitor,SIM)模式,通道1检测药物m/z=529.3,通道2检测内标m/z=455.3。

结果

专属性图1A为空白血样的SIM图,图1B为空白血样加罗库溴铵及内标的SIM图,图1C为患者2静注0.9 mg/kg的罗库溴铵90 min后采集血样的SIM图,结果显示罗库溴铵及内标在实验条件下均有较好的保留与分离,罗库溴铵和内标的测定处均未见明显干扰。

线性范围和灵敏度取罗库溴铵浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5及10 μg/mL的标准血样并按照“血浆样品前处理”进行操作并进样分析,得到罗库溴铵以及内标的峰面积。以罗库溴铵的理论浓度为自变量x,罗库溴铵与内标物的峰面积比值为因变量y,并且以1/x2为权重,用加权最小二乘法作线性回归。同时计算校正标样回算浓度(表1)处于标示值的95.36%～103.39%,符合指导原则的要求。显示本方法在0.1～10 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。在S/N=10的条件下,可对浓度为0.1 μg/mL的罗库溴铵血样进行含量测定。

A:Blank plasma; B:Plasma spiked with Rocuronium bromide (0.1 μg/mL) and IS (0.5 μg/mL);C:Plasma collected at 90 min after intravenous injection of patient 2 spiked with IS (0.5 μg/mL).

图1　LC-MS法测定人血中罗库溴铵的典型色谱图

a:y=0.001 870+0.651x;b:y=0.001 111+0.707x;c:y=0.003 607+0.676x.

精密度与准确度选取高 (7.5 μg/mL)、中 (1 μg/mL)、低 (0.2 μg/mL)以及定量限 (0.1 μg/mL)共4个浓度,另行配制。在同一天内对每一考察浓度平行配制5个样品进行分析,连续测定3天,每日绘制随行标准曲线。进行日内和日间精密度、准确度的考察。精密度以相对标准偏差 (relative standard devia-tion,RSD)进行衡量,准确度以方法回收率来衡量。

结果显示(表2),本方法的日间和日内相对标准偏差 (RSD%)≤6.94%;方法回收率在85%～115%,仅有一个位于定量下限 (0.1 μg/mL)的样品方法回收率115.2%,也在标准范围 (定量下线为标示值±20%)之内，符合指导原则的要求。

基质效应和提取回收率选择0.2、1、5 μg/mL 3个浓度进行基质效应的考察。由空白基质提取后加入分析物和内标测得基质存在下峰面积 (G1组),由分析物和内标的纯溶液测得不含基质的相应峰面积 (G2组)。由峰面积之比得到待测物及内标的基质因子,并由此计算经内标归一化的基质因子。结果如表3所示,3个浓度经内标归一化的基质因子的变异系数均小于15%,符合指导原则的要求。

表2　分析方法的精密度与准确度

表3　各浓度样品的基质效应

空白血样加入分析物和内标,预处理后进样得相应峰面积 (G3组),由G3组与G1组峰面积之比可求得提取回收率,3个浓度及内标的提取回收率分别为103.35%、101.98%、102.41%和104.89%,符合要求。

稳定性

样品冻融循环稳定性配制0.2 μg/mL以及7.5 μg/mL两个浓度的模拟血样,置于-20 ℃冰箱中,冻融3次后进行测定,结果为标示浓度的91.07%～103.23%。

短期放置稳定性配制0.2 μg/mL以及7.5 μg/mL两个浓度的模拟血样,样品分别于4 ℃及25 ℃放置2、4 h后处理进样,结果为标示浓度的89.12%～101.55%。

ALS放置稳定性实验样品处理后进样并于4、8 h后重复进样测定,结果为标示浓度的88.45%～109.82%。

以上测定结果与标示浓度相比较偏差均在±15%之内,符合指导原则的要求。

样品测定按照所建立的方法,对两组临床样本进行测定(图2),考察静注0.9 mg/kg的罗库溴铵后2 h内的血药浓度变化,取血时间分别为注射后5、10、20、30、60、90和120 min。

讨论

色谱柱选择罗库溴铵是一类季铵盐,在一般的反相色谱条件下不易保留。实验中分别采用①Syncronis C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm),②Venusil XBP Phenyl (2.1 mm×100 mm,5 μm),③Luna NH2(4.6 mm×250 mm,5 μm),④Syncronis HILIC (2.1 mm×100 mm,5 μm)和⑤Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm)等柱子进行了尝试,结果显示⑤号柱对罗库溴铵和内标均有较好保留。故本实验选择⑤号柱进行分离。

色谱条件优化以乙腈-水为流动相,分别对有机相的比例和水相pH进行了考察,综合考虑保留时间和峰形后,选择乙腈水相为60∶40,水相pH为5.5 (5 mmol/L甲酸铵,用甲酸调节pH)。此外,将柱温由30 ℃升至40 ℃时,峰形明显改善。

质谱条件选择确定色谱条件后,进样质谱扫描 (扫描范围150～600),得总离子流图,根据罗库溴铵以及内标相对应的保留时间质荷比情况最终选择m/z=529.3检测罗库溴铵以及m/z=455.3 检测内标盐酸维拉帕米(图3)。

本实验根据相关指导原则,建立了LC-MS联用的方法来测定静注2 h内罗库溴铵血药浓度的方法,并成功应用于临床样品的测定,为药物临床监测及相关研究提供了依据。

参考文献

[1]MUIR AW,HOUSTON J,GREEN KL,etal.Effects of a new neuromuscular blocking agent (Org 9426) in anaesthetized cats and pigs and in isolated nerve-muscle preparations[J].BrJAnaesth,1989,63 (4):400-410.

[2]KHUENL-BRADY KS,SPARR H.Clinical pharma-cokinetics of rocuronium bromide[J].ClinPharmacokinet,1996,31 (3):174-183.

[3]ATHERTON DP,HUNTER JM.Clinical pharma-cokinetics of the newer neuromuscular blocking drugs[J].ClinPharmacokinet,1999,36 (3):169-189.

[4]FARENC C,ENJALBAL C,SANCHEZ P,etal.Quantitative determination of rocuronium in human plasma by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry[J].JChromatogrA,2001,910 (1):61-67.

[5]DE MORAES NV,LAURETTI GR,FILGUEIRA GC,etal.Analysis of rocuronium in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with application in clinical pharmacokinetics[J].JPharmBiomedAnal,2014,90:180-185.JP

[6]GORYNSKI K,BOJKO B,KLUGER M,etal.Development of SPME method for concomitant sample preparation of rocuronium bromide and tranexamic acid in plasma[J].JPharmBiomedAnal,2014,92:183-192.

Quantitative determination of Rocuronium bromide in human plasma by a liquid chromatography-tandem mass spectrum method

JIANG Guo-ting1, WANG Ting-ting2, SUN Shen2, YU Yun-qiu1△

(1DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai201203,China;2DepartmentofAnesthesiology,ObstetricsandGynecologyHospital,FudanUniversity,Shanghai200090,China)

【Abstract】ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrum (LC-MS) method to determine the concentration of Rocuronium bromide in plasma． The method was applied to the plasma of patients who use the drug via intravenous injection within 2 hours．MethodsAfter addition of Verapamil Hydrochloride as internal standard (IS),plasma samples were precipitated by acetonitrile.After centrifuging,the supernate was taken to analysis． The separation was carried out on an Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm) column,and the mobile phase was acetonitrile-ammonium formate (60∶40,5 mmol/L,pH=5.5) at a rate of 1 mL/min with a three-way valve after the column to separate the flow and control the flow which runs in the mass spectrum at a rate of 0.2 mL/min． An electrospray ionization (ESI) was adopted as the interface.The samples were detected in positive mode with selected ion monitor (SIM)． ResultsA good linearity was obtained in the range of 0.1～10 μg/mL,and the accuracy,stability and other parameters of the method meet the detecting require for biological samples.ConclusionsLC-MS method is a simple,rapid and accurate method that can be applied to measuring the concentration of Rocuronium bromide in plasma,and it′s also succeed in measuring the clinical samples within 2 hours．

【Key words】Rocuronium bromide;liquid chromatography-tandem mass spectrum method;intravenous injection;selected ion monitor

(收稿日期:2015-09-01;编辑:王蔚)

【中图分类号】R917

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.016

△Corresponding authorE-mail:yqyu@shmu.edu.cn