重组大肠杆菌转化富马酸生产L-丙氨酸

徐友强，马玉岳，姚　粟，姜增妍，张　奇，张　露，裴疆森，程　池

(1. 中国食品发酵工业研究院，北京100015；

2. 山东省富马酸生物转化工程技术研究中心，山东烟台265709)



重组大肠杆菌转化富马酸生产L-丙氨酸

徐友强1，马玉岳2，姚粟1，姜增妍2，张奇1，张露1，裴疆森1，程池1

(1. 中国食品发酵工业研究院，北京100015；

2. 山东省富马酸生物转化工程技术研究中心，山东烟台265709)

摘要：通过克隆来源于睾丸酮丛毛单胞菌的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因，在一株具有L-天冬氨酸酶生产能力的大肠埃希氏菌CICC 11022S中异源表达，构建转化富马酸生产L-丙氨酸的重组工程菌。结果发现：重组工程菌9 h转化富马酸产生112.7 g/L的L-丙氨酸，生产速率12.5 g/(L·h)，转化率93.8%。富马酸价格较低，有效降低L-丙氨酸生产的原料成本。通过构建重组工程菌，以富马酸为底物，高效生产L-丙氨酸，结果表明该方法具有较好的工业应用潜力。

关键词：L-丙氨酸；L-天冬氨酸酶；L-天冬氨酸-β-脱羧酶；重组工程菌

L-丙氨酸是一种具有重要价值的氨基酸，在医药和食品行业应用广泛。L-丙氨酸甜味柔和，能与谷氨酸钠制成混合调味品，可调制并明显改善食品风味，而不破坏食物原有的风格[1]；是合成甜味剂阿力甜的主要原料，阿力甜的甜度是蔗糖的2 000倍，目前已在多个国家和地区获准使用[2-3]；是合成维生素B6和L-氨基丙醇(盐酸左氧氟沙星合成前体)的重要中间体，也是营养剂补糖氨基酸营养输液的组成成分之一[4-6]。最近，有研究利用L-丙氨酸合成N-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-alanine，用于检测牛奶中的抗生素氧氟沙星(ofloxacin)，极大提高了检测的灵敏度[7]；还有研究将L-丙氨酸与电子自旋共振(electron spin resonance,ESR)联合用于癌症放疗剂量的评估，效果显著[8]。

L-丙氨酸生产技术包括化学合成法、蛋白水解提取法和微生物转化法。其中，微生物转化法是现在应用最广泛的L-丙氨酸生产方法。徐虹等[9]选育具有高L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的假单胞菌，以L-天冬氨酸为底物，采用游离细胞法生产L-丙氨酸，每升培养液可转化L-天冬氨酸2.0 kg。现有L-丙氨酸生产工艺以L-天冬氨酸作为原料，L-天冬氨酸价格较高，而且转化过程脱去羧基，造成了碳流失，从而显著增加了生产成本。L-天冬氨酸微生物转化生产是利用微生物产生的L-天冬氨酸酶，转化底物富马酸和氨水实现的，其转化生产过程如图1所示。

图1　　　L-天冬氨酸和L-丙氨酸的微生物转化生产过程Fig.1　　　Process of L-aspartic acid and L-alanine　　　transformation by microorganisms

富马酸价格仅为L-天冬氨酸的40%左右，可以有效降低原料成本。前期有研究对产L-天冬氨酸酶的菌株和L-天冬氨酸-β-脱羧酶的菌株进行固定，利用固定化细胞以富马酸和氨水为底物，26 h可以催化生产1.05 mol/L的L-丙氨酸[10]；还有研究利用纯化的L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶催化富马酸生产L-丙氨酸，但是酶的用量较大，同时生产的效率较低，难于工业化[11]。克隆来源于睾丸酮丛毛单胞菌的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因，在携带L-天冬氨酸酶基因的大肠杆菌中异源表达，构建重组大肠杆菌工程菌，利用双酶耦合催化，以期实现以重组工程菌高效转化富马酸生产L-丙氨酸的工艺技术。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒

菌株EscherichiacoliDH5α购自北京全式金生物技术有限公司，E.coliCICC 11022S为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏菌株。组成型质粒pETPtac和pETPT7在前期工作中构建[12]，pETDuet-1购自Novagen公司。

1.1.2酶和试剂

限制性内切酶，Thermo Scientific公司。高保真DNA聚合酶Fast Pfu，北京全式金生物技术有限公司。T4 DNA连接酶，NEB公司。质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒和DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。氨苄青霉素和硫酸卡那霉素，Sigma公司。其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因asd的克隆

根据PseudomonasdacunhaeATCC 21192的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因序列(GenBank:AB091385.1)设计引物对asd.f(NdeI)/asd.r(XhoI)(表1)，正反向引物分别含有核酸内切酶NdeI和XhoI，扩增asd基因。

PCR反应体系：模板DNA(Comamonastestosteroni基因组)(100 ng/μL)0.5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL，dNTPs(10 mmol/L)4 μL，5× Fast Pfu Buffer 10 μL，Fast Pfu DNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL，ddH2O 33.5 μL。总体积50 μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。

1.2.2组成型重组质粒的构建

提取载体pETPtac、pETPT7和pETDuet-1，核酸内切酶NdeI和XhoI分别处理载体和PCR扩增的asd基因，切胶回收，T4 DNA连接酶连接载体和基因片段，构建载体pETPtac-asd、pETPT7-asd和pETDuet-asd。

以pETPtac-asd为模板，设计引物对Ptac.f(MluI)/asd.r(EcoR I)(表1)扩增DNA片段Ptac-asd(PCR体系和条件同asd基因的克隆)，核酸内切酶MluI和EcoR I处理PCR扩增的Ptac-asd，插入载体pETDuet-asd的MluI和EcoR I，替换载体的lacI调控基因和T7启动子，构建载体pETPtac-asd-PT7-asd，可以不经诱导，起始下游基因的表达。

1.2.3培养基

LB液体培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。115 ℃灭菌30 min。

LB固体培养基在液体培养基基础上添加20 g/L琼脂粉。

表1　引物序列

注：f表示正向引物，r表示反向引物；下划线处为核酸内切酶位点。

发酵液体培养基(g/L)：富马酸10，玉米浆干粉10，MgSO40.2，KH2PO41.0，NaCl 1.5。氨水调节pH 6.5～7.5，115 ℃灭菌30 min。

发酵固体培养基在液态培养基基础上添加20 g/L琼脂粉。

1.2.4培养方法

将基因工程菌株划线到含有100 mg/L氨苄青霉素或者50 mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基平板上，(37±1) ℃培养(12±2) h。

无菌条件下，挑取平板上的单菌落，接种到含有100 mg/L氨苄青霉素或者50 mg/L硫酸卡那霉素的发酵培养基中，(37±1) ℃摇床培养(12±2) h，获得基因工程菌株的菌液。

将菌液以体积分数1.0%接种量接种到含有100 mg/L氨苄青霉素或者50 mg/L硫酸卡那霉素的发酵培养基中，(37±1) ℃摇床200 r/min培养(12±2)h，获得基因工程菌株的发酵液。

E.coliCICC 11022S作为对照，以不加抗生素的培养基进行培养。

1.2.5转化方法

不同菌株转化富马酸生产L-丙氨酸：紫外可见分光光度计600 nm测定发酵液的吸光度，以无菌生理盐水统一调节E.coliCICC 11022S、E.coli/pETPtac-asd、E.coli/pETPT7-asd和E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd的OD600为7.0。将富马酸以氨水调节pH为8.0，配制富马酸铵饱和溶液。然后将菌液与富马酸铵溶液以体积比1∶ 1进行混合，调节温度(45±1) ℃，转速200 r/min，进行转化，0和12 h分别取样，高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)标准曲线法测定富马酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的浓度。以L-丙氨酸的浓度高低确定最优的重组菌株。

不同温度培养菌体催化生产L-丙氨酸：将活化的菌株以1%接种量接种发酵培养基，(37±1)℃摇床200 r/min培养(12±2) h，然后将菌液与富马酸铵溶液以体积比1∶ 1进行混合，调节温度(45±1) ℃，转速200 r/min进行转化，0和12 h分别取样，HPLC标准曲线法测定富马酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的浓度。以L-丙氨酸的浓度高低确定最优培养温度。

全细胞高密度催化生产L-丙氨酸：离心收集菌体，无菌生理盐水悬浮，制备浓度100 OD的菌悬液，然后以菌悬液与富马酸铵溶液以体积比1∶ 6混合，调节温度(45±1) ℃，转速200 r/min，0、3、6、9和12 h分别取样，HPLC标准曲线法测定富马酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的浓度。

以上催化实验均通过500 mL三角瓶进行，装液量50 mL。

1.2.6分析方法

1)富马酸HPLC测定条件。

样品处理：样品稀释合适倍数，0.22 μm滤膜过滤后HPLC检测。

样品检测：色谱柱为Prevail organic acid(5 μm，250 mm × 4.6 mm)，紫外检测器检测波长210 nm，柱温30 ℃，流速0.6 mL/min，进样量10 μL，流动相为0.01 mol/L KH2PO4溶液(H3PO4调节pH为2.3)与甲醇(体积比为95∶ 5)。

2)L-天冬氨酸和L-丙氨酸样品通过异硫氰酸苯酯(PITC)衍生定量检测。

样品衍生：样品400 μL + 0.5 g/L正亮氨酸溶液20 μL + 0.1 mol/L PITC-乙腈溶液200 μL + 1 mol/L三乙胺-乙腈溶液200 μL，涡旋振荡混匀后室温放置60 min，然后加入800 μL正己烷，涡旋振荡1 min，静置10 min。用注射器吸取下层溶液，0.22 μm滤膜过滤后HPLC检测。

样品检测：色谱柱为ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm × 150 mm)，紫外检测器设定波长为254 nm，柱温38 ℃，流速设定为0.6 mL/min，进样量10 μL，流动相A为0.1 mol/L pH 6.5的乙酸铵-乙腈(体积比97∶3)溶液，流动相B为乙腈溶液。洗脱程序为0～ 8 min流动相B的比例18%，8～16 min流动相B的比例由18%梯度升高到80%。

2结果与讨论

2.1L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因asd的克隆和表达载体构建

以C.testosteroni基因组DNA为模板，经PCR扩增后，电泳分析，得到1条约1.6 kb的条带，结果如图2(a)所示，其大小与L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因(asd)的理论大小一致。将其插入载体pETPtac、pETPT7和pETDuet-1，构建表达载体pETPtac-asd、pETPT7-asd和pETDuet-asd，然后以pETPtac-asd为模板，构建asd基因双拷贝的组成型表达载体pETPtac-asd-PT7-asd。将载体pETPtac-asd、pETPT7-asd和pETPtac-asd-PT7-asd转化大肠杆菌E.coliCICC 11022S，构建基因工程菌株E.coli/pETPtac-asd、E.coli/pETPT7-asd和E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd，其单酶切验证如图2(b)、2(c)、2(d)所示。

(a)：M1—DL2000Marker，1—asd基因；(b)：M2—DNA Marker，1—Xho I酶切处理pETPtac，2—pETPtac-asd；(c)：M2—DNA Marker，1—Xho I酶切处理pETPT7，2—pETPT7-asd；(d)：M2—DNA Marker，1—Xho I酶切处理pETDuet-1，2—pETPtac-asd-PT7-asd图2　　　asd基因PCR扩增，质粒pETPtac-asd、pETPT7-asd和pETPtac-asd-PT7-asd单酶切验证Fig.2　　　PCR amplification of asd,restrication enzyme verification of pETPtac-asd,pETPT7-asd and pETPtac-asd-PT7-asd

2.2菌株E.coliCICC 11022S，E.coli/pETPtac-asd，E.coli/pETPT7-asd和E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd生产L-丙氨酸比较

为了使工程菌株在实际工业应用中操作更加简单，构建的基因工程菌株均为不经诱导操作、起始下游基因表达的组成型表达基因工程菌株。不同菌株转化富马酸生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸结果如表2所示。

表2　不同菌株转化富马酸生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸

注：a—细胞密度OD600为产酶发酵后的OD值；b—富马酸质量浓度为反应体系初始浓度与反应完毕残留浓度的差值。

Takamatsu等[10]研究结果和表2结果均表明，组成型表达的重组菌株可以不经诱导操作，有效地进行异源基因表达。重组菌株E.coli/pETPtac-asd,E.coli/pETPT7-asd和E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd均可以转化富马酸生产L-丙氨酸。其中，以E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd生产L-丙氨酸的能力最佳，12 h共产生54.76 g/L的L-丙氨酸，生产速率4.56 g/(L·h)，同时还生产了16.01 g/L的L-天冬氨酸。与之相比，出发菌株不能产生L-丙氨酸，12 h共生产了L-天冬氨酸100.95 g/L。以上结果表明，成功构建得到L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶双酶共表达的重组菌株，实现了以富马酸为底物、生产L-丙氨酸的工艺技术。该结果还表明，通过增加L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的拷贝数，可以提高L-丙氨酸的生产速率。后续可以开展L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因表达的系统优化，在不影响细胞生长代谢的条件下，进一步提高工程菌的生产效率。

2.3重组菌株E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd不同温度培养对L-丙氨酸转化的比较

温度对重组菌株的基因异源表达影响较大[13]，故对重组菌株E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd在不同温度下进行培养，然后同一条件进行转化，考察培养温度对重组菌株转化生产L-丙氨酸的影响，结果如图3所示。

图3　　　温度对E. coli/pETPtac-asd-PT7-asd　　　生产L-丙氨酸的影响Fig.3　　　 Effects of different culture temperature on L-alanine　　　production by E. coli/pETPtac-asd-PT7-asd

由图3可知：37 ℃培养E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd，与其他培养温度相比，所得等体积发酵液具有最高效的L-丙氨酸转化能力。12 h共产生L-丙氨酸56.66 g/L，略优于30 ℃发酵液(52.77 g/L)。由于大肠杆菌的最适培养温度为37 ℃，温度上升，其菌体生长能力下降明显，故没有进行40 ℃以上培养E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd的实验。

2.4重组菌株E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd全细胞高密度转化富马酸生产L-丙氨酸

图4　　　E. coli/pETPtac-asd-PT7-asd全细胞　　　高密度生产L-丙氨酸Fig.4　　　Production of L-alanine by high cell density of　　　E. coli/pETPtac-asd-PT7-asd

为进一步提高L-丙氨酸生产效率，尝试了高密度转化方式，结果如图4所示。由图4可知：E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd 9 h可以转化154.3 g/L富马酸产生112.7 g/L L-丙氨酸，生产速率12.5 g/(L·h)，转化率93.8%。

3结论

首次尝试通过重组菌株双酶耦合表达，实现了以富马酸为底物、转化生产L-丙氨酸的工艺技术，降低了生产的原料成本。全细胞高密度催化结果表明，重组菌株9 h可以转化154.3 g/L富马酸产生112.7 g/L L-丙氨酸，生产速率12.5 g/(L·h)，转化率93.8%，表明该重组菌株具有一定的工业应用价值。

参考文献：

[1]张维刚,丁学杰.相转移催化合成DL-丙氨酸的研究[J].精细化工,1999,16(5):38-40.

[2]凌关庭.阿力甜及其FAO/WHO(1995)标准[J].中国食品添加剂,1996(2):21-24.

[3]杨海燕,张日生.阿力甜:性质优良的甜味剂[J].中国食品添加剂,2000(3):23-25.

[4]陈天豪,李仁宝,杨威.维生素B6的合成工艺改进[J].中国医药工业杂志,2004,35(1):1-2.

[5]苗华,孙兰英,郭惠元.(S)-2(+)-2-氨基丙醇的制备[J].中国医药工业杂志,1998,29(10):470.

[6]董学伟,张春枝,金凤燮.中空纤维膜反应器转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸[J].食品与发酵工业,2003,29(1):32-35.

[7]ZHAO T,YU B F,TANG W J,et al.Spectrofluorimetric determination of ofloxacin in milk withN-(9-f￣l￣u￣o￣r￣e￣n￣y￣l￣m￣e￣t￣h￣y￣l￣o￣x￣y￣c￣a￣r￣b￣o￣n￣y￣l)-l-alanine[J].Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc,2015,148:125-130.

[8]RECH A B,BARIBI G L,VENTURA L H,et al.In vivo dose evaluation during gynaecological radiotherapy using l-alanine/ESR dosimetry[J].Radiat Prot Dosimetry,2014,159(1-4):194-198.

[9]徐虹,王雪根,朱建良,等.L-丙氨酸酶法工业生产的研究[J].工业微生物,1997,27(2):17-20.

[10]TAKAMATSU S,UMEMURA I,YAMAMOTO K,et al.Production of l-alanine from ammonium fumarate using two immobilized microorganisms[J].Eur J Appl Microbiol Biotechnol,1982,15:147-152.

[11]JANDEL A S,HUSTEDT H,WANDREY C.Continuous production of l-alanine from fumarate in a two-stage membrane reactor[J].Eur J Appl Microbiol Biotechnol,1982,15:59-63.

[12]XU Y,CHU H P,GAO C,et al.Systematic metabolic engineering ofEscherichiacolifor high-yield production of fuel bio-chemical 2,3-butanediol[J].Metab Eng,2014,23:22-33.

[13]GöRANSSON M,SONDéN B,NILSSON P,et al.Transcriptional silencing and thermoregulation of gene expression inEscherichiacoli[J].Nature,1990,344:682-685.

(责任编辑管珺)

Transformation of fumaric acid for the production of L-alanine by recombinantEscherichiacoli

XU Youqiang1,MA Yuyue2,YAO Su1,JIANG Zengyan2,ZHANG Qi1,ZHANG Lu1,PEI Jiangsen1,CHENG Chi1

(1. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China;2. Engineering Technology Research Center of Fumaric Acid Biotransformation in Shandong Province,Yantai 265709,China)

Abstract：The gene coding for L-aspartate-β-decarboxylase from Comamonas testosteroni was cloned and expressed in an Escherichia coli strain CICC 11022S with the capability for L-aspartic acid production. The recombinant strain was used for the synthesis of L-alanine. The recombinant strain produced 112.7 g/L L-alanine from fumaric acid with a rate of 12.5 g/(L·h)and a conversion ratio of 93.8%. Fumaric acid has a low price,which efficiently reduces the substrate cost for L-alanine production. L-alanine was producd from fumaric acid by using the recombinant strain,and the results showed that the technology had industrial application potential.

Keywords：L-alanine;L-aspartase;L-aspartate-β-decarboxylase;recombinant strain

中图分类号：Q78

文献标志码：A

文章编号：1672-3678(2016)02-0007-05

作者简介：徐友强(1986—)，男，山东青州人，博士，工程师，研究方向：发酵工程；程池(联系人)，教授级高级工程师，E-mail:cheng100027@163.com

基金项目：烟台市科技发展计划(2014SF151)；中国食品发酵工业研究院2015年科技发展基金(博士专项)(2015KJFZ-BS-03)

收稿日期：2015-07-21

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.002