通过透明颤菌血红蛋白基因表达提高γ-聚谷氨酸的生物合成

汤　宝，冯小海，张　丹，许宗奇，姜永翔，李　莎，徐　虹

(南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京211800)



通过透明颤菌血红蛋白基因表达提高γ-聚谷氨酸的生物合成

汤宝，冯小海，张丹，许宗奇，姜永翔，李莎，徐虹

(南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京211800)

摘要：γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的微生物合成是高消耗氧的生物过程，采取基因工程手段改造γ-PGA生产菌株Bacillus subtilis NX-2，以提高细胞利用氧的能力。利用重叠PCR方法将P43强启动子与透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb拼接，插入大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5上，得到重组质粒pMA5-P43-vgb，并将其转化至B. subtilis NX-2中，从而获得重组菌B.subtilis NX-2(vgb+)。经SDS-PAGE分析和CO差光谱法证明VHb能在γ-PGA生产菌株中成功表达，且具有生理活性，大小约为1.6×104。在7.5 L发酵罐上对重组菌B. subtilis NX-2(vgb+)进行发酵性能考察，结果显示：重组菌比出发菌的生物量提高了41.2%，γ-PGA的产量提高了7.5%，传代多次表明重组菌具有良好的发酵稳定性。该研究为γ-PGA的进一步工业化生产奠定了基础。

关键词：Bacillus subtilis；透明颤菌血红蛋白；γ-聚谷氨酸

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由微生物合成的细胞外氨基酸聚合物，由D型和L型谷氨酸通过γ-酰胺键连接而成[1]。具有保湿性和生物可降解性等理化和生物学特性，在环境、医药、食品和化妆品等领域具有广泛的应用前景[2-3]，是不可降解的合成高分子材料(如塑料和水凝胶等)优良的替代品。因此，开发该产品有利于加快我国高分子产业和产品结构向绿色化、功能化方向发展。

透明颤菌血红蛋白(VHb)是透明颤菌中的氧调节蛋白，能够在极低的溶氧环境条件下大量合成，使得菌体在恶劣的贫氧环境中也能较好地生存。科学家们利用VHb的这一功能，首次将血红蛋白基因(vgb)在大肠杆菌中进行克隆表达，发现VHb的导入可以在细胞水平上改善O2的供应，提高氧化磷酸化水平和ATP再生能力，从而加快细胞的生长和代谢[4]。自从VHb在大肠杆菌中成功表达以来，该蛋白已被广泛应用于耗氧量大、溶氧易成为限制因素的工业微生物生产领域。Kallio等[5]将vgb基因在产α-淀粉酶的枯草芽胞杆菌中进行表达，提高了菌体生长和产酶能力；郭晓军等[6]将vgb基因成功导入黄单胞杆菌，极大地提高了黄原胶的产量；VHb还被用于抗生素工业，Demodena等[7]通过在枝顶青霉菌种中表达该蛋白提高了头孢菌素C的产量，Brunker等[8]也应用该蛋白的表达来促进糖多孢红霉素菌产红霉素的含量。但VHb应用于γ-PGA发酵生产的未见报道。因此，为了提高γ-PGA生产菌在低溶氧环境条件下对氧的利用能力，构建VHb表达的基因工程菌是一种有效的策略。

本研究中，笔者以BacillussubtilisNX-2为研究对象，将强启动子P43与vgb基因连接，构建到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5上，并将构建的血红蛋白基因重组表达载体转化到B.subtilisNX-2，考察VHb表达对γ-PGA合成及菌体生长的影响。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株及质粒

大肠杆菌E.coliJM109、枯草芽胞杆菌B.subtilis168、枯草芽胞杆菌B.subtilisNX-2、大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5均保存于笔者所在实验室，携带透明颤菌血红蛋白基因vgb的质粒pOK12为中国科学院上海生化研究所惠赠。

1.1.2工具酶及试剂

限制性内切酶、连接酶、Ex Taq等酶均为TaKaRa公司产品，引物合成、测序由南京金斯瑞公司完成，其余试剂为进口或国产市售分析纯。

1.1.3培养基及培养条件

大肠杆菌和枯草芽胞杆菌分子实验中均采用LB培养基(g/L)：NaCl 10，蛋白胨10，酵母粉5。大肠杆菌抗性培养基中各个抗生素的质量浓度(μg/mL)：氨苄青霉素50，氯霉素25，卡那霉素 25，四环素40。枯草芽胞杆菌抗性培养基中各个抗生素的质量浓度(μg/mL)：氯霉素10，卡那霉素25，四环素5。

B.subtilisNX-2发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，酵母膏5，谷氨酸钠50，K2HPO4·3H2O 8，MgSO40.25；pH 7.0。

种子液培养：接一环菌于装有80 mL种子培养液的500 mL三角瓶中，220 r/min、32.5 ℃培养16 h。

发酵罐培养：7.5 L发酵罐，装液量4 L，配两档圆盘透平桨，罐径与桨径长度比为2∶ 1，121 ℃灭菌15 min，接种量2%，发酵温度32.5 ℃，搅拌转速400 r/min，通气量1.2 L/min。

1.1.4引物

本实验所用引物如表1所示。

表1　本实验所用引物

1.2实验方法

基因组提取、质粒提取、酶切、连接、SDS-PAGE分析以及大肠杆菌转化等分子生物学技术均参照文献[9]的方法。

1.2.1重叠PCR连接启动子P43和vgb基因

重叠PCR分两步进行。第一步反应体系如下：含10×PCR buffer 2.5 μL、Mg2+2 μL、dNTP 2 μL、模板P43和vgb各2 μL、Ex Taq DNA聚合酶 0.5 μL，加重蒸水至反应液总体积为25 μL。扩增程序如下：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性55 s，65 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸1 min，循环5次；72 ℃ 延长2 min。第二步在第一步基础上再加入25 μL反应物质，体系如下：10×PCR buffer 5 μL，Mg2+2 μL，dNTP 4 μL，待重叠片段模板P43上游引物和模板vgb下游引物各2 μL，Ex Taq DNA 聚合酶1 μL，加重蒸水至反应液总体积为50 μL。扩增程序如下：95 ℃ 退火4 min；94 ℃变性50 s，55～60 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸1 min，循环30次；72 ℃ 延长10 min。

1.2.2重组表达质粒pMA5-P43-vgb的构建

质粒构建流程如图1所示，将PCR得到的P43和vgb基因片段回收，经过重叠PCR扩增与穿梭质粒pMA5经过NdeI和BamH I双酶切后过夜连接， 获得重组表达载体pMA5-P43-vgb，转化大肠杆菌JM109，挑选单克隆，经菌体PCR、质粒双酶切验证。

图1　　　重组表达质粒pMA5-P43-vgb的构建流程Fig.1　　　Construction of recombinant plasmid　　　pMA5-P43-vgb

1.2.3重组表达质粒pMA5-P43-vgb转化枯草芽胞杆菌

重组表达质粒pMA5-P43-vgb转化枯草芽胞杆菌参照电转化方法[10]。

1.2.4检测方法

CO差光光谱法检测透明颤菌血红蛋白VHb的表达活性，参照文献[11]。

细胞生长的测定：将发酵液稀释25倍后通过分光光度计于660 nm处读取吸光值。

γ-PGA含量的测定参照文献[12]。

2结果与讨论

2.1启动子P43和透明颤菌血红蛋白基因vgb的扩增以及重叠PCR连接

根据表1中引物，分别以B.subtilis168基因组、pOK12质粒为模板，PCR扩增得到P43启动子片段、含有自身启动子序列的vgb基因片段。所获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2和图3所示。由图2和图3可知：大小约400、470 bp，与预期结果一致。将上述P43启动子片段及vgb基因切胶回收作为重叠模板，以P43-F及vgb-R作为引物进行重叠PCR。重叠片段经切胶回收后如图4所示。由图4可知：条带大小约为850 bp，表明已将P43启动子与vgb基因连接。

M—DNA标准品；1～2—P43启动子片段图2　　　P43启动子片段的PCR扩增电泳Fig.2　　　PCR amplification of the promoter P43

M—DNA标准品；1～2—vgb基因片段图3　　　vgb基因的PCR扩增电泳Fig.3　　　PCR amplification of the vgb gene

M—DNA标准品;1～2—P43-vgb重叠片段图4　　　重叠PCR扩增的P43-vgb片段Fig.4　　　Over-lapping PCR amplification of the　　　 P43-vgb products

2.2重组表达质粒pMA5-P43-vgb的构建及验证

重叠片段测序结果表明P43启动子序列与vgb基因序列没有发生碱基的缺失和改变。将该重叠片段与pMA5质粒用NdeI和BamH I进行双酶切后连接，按照图1中流程构建重组表达质粒pMA5-P43-vgb，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆进行菌液PCR验证，结果见图5。再将 PCR 验证有正确条带的转化子提取质粒进行双酶切验证，结果如图6所示。图5、图6结果表明重组载体pMA5-P43-vgb构建成功。

M—DNA标准品；1～4—菌液PCR验证P43-vgb片段图5　　　重组质粒pMA5-P43-vgb的PCR验证Fig.5　　　Colony PCR profile of recombinant　　　plasmid pMA5-P43-vgb

M—DNA标准品;1～2—Nde I和BamH I双酶切pMA5-P43-vgb图6　　　重组质粒pMA5-P43-vgb的酶切验证Fig.6　　　Restriction analysis of recombinant　　　plasmid pMA5-P43-vgb

2.3VHb在B.subtilisNX-2中的表达及鉴定

2.3.1pMA5-P43-vgb转化B.subtilisNX-2

采用电转化方法将pMA5-P43-vgb重组质粒转化B.subtilisNX-2，在卡那霉素抗性平板上进行筛选，挑取3个转化子。将这3株重组菌全部挑取至含有卡那霉素抗性的液体培养基中，提取质粒验证，结果如图7所示。由图7可知：泳道1为出发菌B.subtilisNX-2提取质粒结果，表示宿主菌中不存在质粒；泳道 2、3、4分别是3株重组菌提取质粒的结果，表明3株重组菌中均有质粒转入。为进一步验证质粒是否是重组载体pMA5-P43-vgb，分别用NdeI和BamH I 对这3个质粒进行双酶切，结果如图7的泳道5、6和7所示，均有7 500 bp和850 bp的条带，说明 pMA5-P43-vgb已经成功转入B.subtilisNX-2，将重组菌命名为B.subtilisNX-2(vgb+)。

M—DNA标准品；1—B.subtilis NX-2质粒提取结果；2～4—重组菌质粒提取结果；5～7—Nde I和BamH I双酶切重组菌质粒pMA5-P43-vgb图7　　　重组菌B. subtilis NX-2(vgb+)的验证Fig.7　　　Confirmation of recombinant B. subtilis NX-2(vgb+)

2.3.2SDS-PAGE检测重组菌株的血红蛋白VHb的表达

通过SDS-PAGE检测重组菌B.subtilisNX-2(vgb+)中VHb的表达，结果如图8所示。由图8可知：与原始菌B.subtilisNX-2相比，重组菌B.subtilisNX-2(vgb+)成功表达了相对分子质量约1.6×104的蛋白条带，即血红蛋白VHb，与文献报道大小一致[13]。

M—蛋白标准品；1—B. subtilis NX-2(vgb+)总蛋白；2—B. subtilis NX-2总蛋白图8　　　VHb在重组菌B. subtilis NX-2(vgb+)的表达Fig.8　　　VHb protein from recombinant B. subtilis　　　NX-2(vgb+) by SDS-PAGE analysis

2.3.3CO差光谱法检测重组菌VHb的表达活性

透明颤菌血红蛋白在不同的环境条件下可呈现3种不同的状态，即氧化态、还原态、氧合态，并可以相互转化，其中还原态是生理活性态，而氧合态则是富氧条件下的表现形式[14]。若向溶液中鼓入CO气体，则可形成血红蛋白-CO复合物，在419 nm处呈现特征吸收峰。通过CO差光谱法检测，结果如图9所示。由图9可知：重组菌B.subtilisNX-2(vgb+)在419 nm处有明显的特殊吸收峰，而原始菌B.subtilisNX-2没有相应的吸收峰，表明重组菌表达了有生理活性的血红蛋白。

图9　　　重组菌B. subtilis NX-2(vgb+)的CO差光光谱分析Fig.9　　　CO-difference spectra analysis of recombinant　　　B. subtilis NX-2(vgb+)

2.4VHb表达对B.subtilisNX-2发酵的影响

2.4.1VHb对发酵生产γ-PGA的影响

在7.5 L 罐中考察B.subtilisNX-2与B.subtilisNX-2(vgb+)分批发酵合成γ-PGA的过程，结果如图10所示。由图10可知：VHb的表达极大地促进了菌体生长，并且比原始菌提早进入对数期，最终生物量(DCW)达到(6.89±0.20) g/L，比原始菌增加了41.2%。VHb的表达也加快了底物葡萄糖和L-谷氨酸的消耗，但底物的消耗更多地用于菌体生长，对γ-PGA的合成没有明显的促进作用。B.subtilisNX-2(vgb+)发酵合成γ-PGA 产量的最高值为(34.4±0.38) g/L，较原始菌提高了7.5%。或许因为pMA5-P43-vgb作为外源质粒转B.subtilisNX-2，表达效率不高。另外，在发酵过程中，重组菌株的发酵液颜色由微红色逐渐加深，发酵结束时呈现为土黄色。在有氧发酵过程中，由于VHb的表达导致发酵液颜色改变的现象已有报道[12]，或许在长时间的发酵过程中，表达质粒会有少量的丢失，并且血红蛋白呈现的红色与枯草芽胞杆菌的代谢产物长时间混合在一起导致了发酵体系颜色的变化。Kallio等[15]研究发现VHb的表达可以增加细胞中氧的利用效率，使呼吸链末端氧化酶的活性发生改变，提高细菌中ATP的水平，从而提高细胞对氧的利用能力。

图10　　　VHb的表达对γ-PGA分批发酵过程的影响Fig.10　　　Effect of VHb expression on the batch　　　fermentation of γ-PGA

2.4.2重组菌B.subtilisNX-2(vgb+)的发酵稳定性

质粒稳定性是影响基因工程菌外源蛋白表达的重要因素，同时外源蛋白的表达又影响着质粒的稳定性。特别在组成型表达系统中，由于外源蛋白的持续表达，导致细胞代谢负担加重，质粒稳定性的控制比较困难。为考察重组菌B.subtilisNX-2(vgb+)的发酵稳定性，分别将重组菌在含有卡那霉素抗性及无抗性选择压力情况下传代多次，同时以原始菌B.subtilisNX-2在无抗性条件下传代作为对照。随机选取3种培养条件下的第2、4、6、8和10代进行摇瓶发酵，结果见表2。由表2可知： 含有卡那霉素抗性选择压力的重组菌传代培养有较好的发酵稳定性，γ-PGA 产量未有明显下降，且均优于原始菌的发酵结果。而不含有抗性选择压力的重组菌传代培养在第6代之后已没有明显的发酵优势，甚至其γ-PGA 产量还低于原始菌，可能原因是多次无压力的传代培养造成了质粒的丢失，对细胞内微环境造成了不利的影响。由于笔者在保存及活化重组菌过程中都是在含有卡那霉素抗性选择压力的条件下进行的，因此，可以保证质粒的稳定性，不会明显影响VHb表达对γ-PGA发酵的作用效果。

表2　B. subtilis NX-2(vgb+)的发酵稳定性

3结论

通过在B.subtilisNX-2中外源表达透明颤菌血红蛋白基因vgb，从分子水平上提高细胞自身对溶氧的利用能力，最终重组菌的细胞量达到(6.89±0.20) g/L、γ-PGA产量为(34.4±0.38) g/L，相比原始菌分别提高了41.2%、7.5%。因此，在保持现有设备和能耗压力不变的情况下，该策略为解决工业微生物在发酵过程中的供氧不足问题提供了一条新的途径。

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(责任编辑管珺)

Expression ofVitreoscillahemoglobin gene to enhance poly-γ-glutamicacid biosynthesis inBacillussubtilisNX-2

TANG Bao,FENG Xiaohai,ZHANG Dan,XU Zongqi,JIANG Yongxiang,LI Sha,XU Hong

(College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Abstract：Biosynthesis of poly-γ-glutamic acid is an aerobic process. Therefore we tried to transform the strain by genetic engineering to improve its ability of using oxygen. First,the recombinant plasmid pMA5-P43-vgb was constructed with the overlapping PCR method connecting Bacillus subtilis P43 promoter to Vitreoscilla hemoglobin gene vgb,then transformed into Bacillus subtilis NX-2,to obtain a recombinant strain B.subtilis NX-2(vgb+).The molecular size of hemoglobin VHb in recombinant strain B. subtilis NX-2(vgb+)was 1.6×104 by SDS-PAGE.Further,the carbon monoxide difference spectra verified that the target protein had a physiological activity in B. subtilis NX-2(vgb+).The experiments in the 7.5-L fermentor showed that the recombinant strain increased the biomass 41.2% and the γ-PGA production 7.5% than the original strain. The research lay a foundation for the γ-PGA industrial production.

Keywords：Bacillus subtilis;Vitreoscilla hemoglobin;poly-γ-glutamic acid

中图分类号：TB324

文献标志码：A

文章编号：1672-3678(2016)02-0001-06

作者简介：汤宝(1987—)，男，安徽桐城人，博士研究生，研究方向：发酵工程；徐虹(联系人)，教授， E-mail：xuh@njtech.edu.cn

基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)重大项目(2013AA020301)；普通高校研究生科研创新计划项目(KYLX15_0811)

收稿日期：2015-03-10

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.001