葎草中木犀草苷和芦丁的提取工艺研究

赵留存　李　莉　靳凤云　刘乐环　唐秀胜

1.广西壮族自治区宜州市中医医院药剂科，广西　宜州　546300；

2. 贵阳中医学院实验中心，贵州　贵阳　55002；3. 北京中医药大学中药学院，北京　100700



药物研究

葎草中木犀草苷和芦丁的提取工艺研究

赵留存1李莉1靳凤云2*刘乐环3唐秀胜2

1.广西壮族自治区宜州市中医医院药剂科，广西宜州546300；

2. 贵阳中医学院实验中心，贵州贵阳55002；3. 北京中医药大学中药学院，北京100700

【摘要】目的：优选葎草中木犀草苷和芦丁的最佳提取工艺。方法：采用正交实验法，以乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间为考察因素；采用UPLC以木犀草苷和芦丁为考察指标进行含量测定，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C(18)(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：甲醇- 1%冰醋酸溶液(28∶72)；流速：0.15ml/min；检测波长：350nm；柱温：30℃。结果：木犀草苷和芦丁的质量浓度分别在25.8～645μg和12.5～313.2μg范围内与峰面积具有良好的线性关系；最佳提取工艺为加25ml 75%乙醇，回流提取三次，每次1h；影响提取的主次因素为：乙醇浓度>提取次数>提取时间>乙醇用量。工艺验证结果：木犀草苷和芦丁的平均总量为0.267mg/g。结论：优选的提取工艺稳定、可行，有效成分提取率高。

【关键词】葎草；木犀草苷；芦丁；正交试验；提取工艺

葎草为桑科植物葎草Humulusscandens( Lour.) Merr.的全草，别名拉拉秧、锯子草、五爪龙、降龙草等[1]，始载于《唐本草》[2-3]。葎草为一年或多年生草本，除青海、新疆以外，全国各地均有分布，另外东北亚、北美洲也有分布[4]。葎草含有黄酮类、萜类、挥发油类、甾体等化合物[5-7]，具有清热解毒、利尿通淋功效，主治肺热咳嗽、肺痈、虚热烦渴、热淋、水肿、小便不利、湿热泻痢、热毒疮疡、皮肤瘙痒等症[8-9]。目前，葎草的研究主要集中在紫外分光光度法测定葎草中总黄酮的量及HPLC法测定葎草中木犀草素和木犀草苷的含量[10-12]，为更好的控制葎草质量，本文以葎草的有效成分木犀草苷和芦丁为考察指标，采用正交实验法对葎草的提取工艺进行考察，筛选出最佳提取工艺。为以后建立更加全面可靠的葎草质量标准奠定研究基础。

1仪器与材料

1.1仪器超高液相色谱仪(Waters Acquity UPLC H-Class系统，包括四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、PDA检测器和Empower3数据处理工作站，美国waters)；AE240电子天平(上海梅特勒有限公司)；AB204-S分析天平(上海台衡仪器仪表有限公司)；R-200旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)；HS10260D型超声波清洗器(天津奥泰仪器有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(上海浦东物理光学仪器厂)。

1.2材料葎草采自贵阳市花溪区十里河滩，经贵阳中医学院生药教研室王祥培教授鉴定为Humulusscandens( Lour.) Merr.;木犀草苷对照品(批号“111720-201106 )、芦丁对照品(批号：0080-97050，纯度：98.6%)均购中国食品药品检定研究院;甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备精密称定对照品木犀草苷、芦丁适量，加甲醇适量制成每毫升含木犀草苷25.8μg，含芦丁12.5μg的对照品溶液，备用。

2.2色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：甲醇-1%冰醋酸溶液(28∶72)；流速：0.15ml/min；检测波长：350nm；柱温：30℃；进样量：1μl。木犀草苷和芦丁与相邻峰的分离度均大于1.5。UPLC色谱图如下。

2.3线性关系与灵敏度分别精密吸取上述木犀草苷对照品溶液(25.8μg/ml)、芦丁对照品溶液(12.5μg/ml)0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μl ，在上述色谱条件下进样,测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得出木犀草苷线性回归方程：Y=2.4×107X-16133(r=0.9998)；芦丁线性回归方程：Y=1.0×107X-2418.8(r=0.9998)，结果表明，木犀草苷和芦丁质量浓度分别在25.8～645μg和12.5～313.2μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。以3倍信噪比(S/N)对应分析物浓度作为检出限(LOD)，木犀草苷LOD为310.8×10-3μg/ml，芦丁LOD为150.6×10-3μg/ml；以10倍信噪比(S/N)对应分析物浓度作为定量限(LOQ)，木犀草苷LOQ为1036×10-3μg/ml，芦丁LOQ为502×10-3μg/ml。

2.4供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约1.6g，精密称定，置具塞圆底烧瓶中，精密加入75%乙醇25ml，密塞，称定重量，回流提取40min，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。进样前用0.22μm微孔滤膜过滤，吸取1μl，注入超高液相色谱仪，照前述色谱条件进行测定。

2.5精密度取木犀草苷和芦丁对照品溶液，连续进样6次，，每次进样1μl，分别测定峰面积，其中木犀草苷的峰面积RSD为1.32%，芦丁的峰面积RSD为1.86%，表明仪器精密度良好。木犀草苷和芦丁的平均回收率分别为98.28%和99.35%，RSD分别为2.94%和2.94。

2.6葎草提取工艺的设计

2.6.1正交试验设计参考文献[12]，确定用乙醇为提取溶剂，采用回流提取方法，选择提取工艺中对提取含量有影响的四项因素，即乙醇浓度A，乙醇用量B，提取次数C，提取时间D。以木犀草苷和芦丁的总提取含量为评价标准，每个因素选择3个水平，采用四因素三水平正交试验表L9(34)设计试验方案，见表4。

2.6.2正交试验方案及结果由正交试验结果(见表5)和方差分析(见表6)可知：乙醇浓度、提取次数、提取时间对实验结果的差异具有统计学意义，而乙醇用量对实验结果差异无统计学意义，4个因素对实验结果影响大小：乙醇浓度>提取次数>提取时间>乙醇用量，四因素最优水平组合是A2B1C3D2，即加25ml 75%乙醇回流提取3次每次1h。

表4　因素水平表

表5　L9(34)正交试验方案及结果

表6　SPSS软件方差分析结果

注：F0.01(2,2)=99.00

2.6.3验证试验取同一批药材粉末，平行称取三份，每份约1.6g，按最佳提取工艺A2B1C3D2进行验证试验，测定葎草中木犀草苷和芦丁的含量，结果三份药材中木犀草苷和芦丁的总量分别为0.258、0.279、0.263mg/g，因此木犀草苷和芦丁的平均总量为0.267mg/g。工艺验证结果表明，通过正交实验设计得到的葎草中木犀草苷和芦丁的提取率较高、工艺稳定、科学合理。

综上可知，供试液的制备方法为：取葎草粉末(过三号筛)约1.6g，精密称定,置圆底烧瓶中，精密加入75%乙醇25ml，加热回流提取三次，每次1h，滤过，合并三次滤液，用旋转蒸发仪浓缩近干，将浓缩液转移至10ml容量瓶中，加75%乙醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，经0.22μm滤膜过滤，即得。

3讨论

3.1木犀草苷和芦丁是葎草的有效成分，实验通过正交试验设计确定了葎草中木犀草苷和芦丁的显著性影响因素，其中四因素中乙醇浓度是影响最大的因素，其次是提取次数、提取时间，乙醇用量对实验结果没有影响，本实验为以后葎草木犀草苷和芦丁的含量测定提供了最佳提取制备方法。

3.2在葎草指标性成分选择中，先后选择了木犀草素、大波斯菊苷、木犀草苷、芦丁等，结果木犀草素和大波斯菊苷的含量都很低，测定木犀草素在提取过程中需要水解，时间相对较长，通过比较最后选择以木犀草苷和芦丁为指标性成分。

3.3本文通过UPLC法对葎草的提取工艺进行研究，UPLC与HPLC相比，具有分析效率更高、分析时间更短、分离能力更强、灵敏度更高的优点，为今后UPLC法测定葎草的含量提供了依据。

参考文献

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Optimal Extractive Technology of luteolin-7-O-glucoside and rutin inHumulusscandens

ZHAO Liucun1LI Li1JIN Fengyun2*LIU Lehuan3TANG Xiusheng2

1.Dept. of Pharmacy,Yizhou Traditional Chinese Medicine Hospital，Yizhou 546300，China;2.The Experiment Center，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China;3. School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China

Abstract:Objective optimal extractive technology of luteolin-7-O-glucoside and rutin in Humulus scandens. Methods The extraction technology were optimised by the orthogonal experimental method with ethanol concentration, alcohol amount, extraction time and the extraction times as factors. Luteolin-7-O-glu-coside and rutin were as indexes, which were determined by UPLC. ACQUITY UPLC BEH C(18)(100mm×2.1mm，1.7μm) was adopted .The mobile phase consisted of methanol-1%glacial acetic acid(28∶72).The flow rate was 0.15 ml/min.The column temperature was 30℃,and the UV detection wavelength was 350nm．Results The linear range were 25.8-645μg/ml of Luteolin-7-O-glu-coside , 12.5-313.2μg/ml for rutin . the optimal extraction technology is: add 25ml amount of 75% alcohol refluxing extract three times, one hour per time. Major order factors affecting the extraction yield was ethanol concentration，the extraction times，the extraction time，alcohol amount. Process validation show that total production averages 0.267mg/g for luteolin-7-O-glucoside and rutin .Conclusion The optimized extraction techniques is stable and feasible, and the extraction rate of active components is high.

Key words:Humulus scandens; luteolin-7-O-glucoside; rutin; orthogonal experiment; extraction techniques

(收稿日期：2015.12.30)

【中图分类号】R284.2

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2016)06-0016-04

作者简介：赵留存(1984-)，山东菏泽人，硕士研究生，执业中药师，主要从事中药新制剂、中药质量控制与新药研发。E-mail：zhaoliucun@126.com。通信作者：靳凤云(1954-)，女，教授，山东菏泽人，硕士研究生导师，主要从事中药质量控制与新药研发。E-mail：jinfengyun01@163.com。

基金项目：贵州省教育厅自然科学研究项目(黔教科(2011)048号)。