中国邢台地区Leber遗传性视神经病变分子流行病学调查研究

解世朋,王　浩,常永业, 石慧君, 管敏鑫, 张铭连



·调查研究·

中国邢台地区Leber遗传性视神经病变分子流行病学调查研究

解世朋1,王浩1,常永业1, 石慧君1, 管敏鑫2, 张铭连1

Molecular epidemiology of Leber hereditary optic neuropathy in Xingtai China

Shi-Peng Xie1, Hao Wang1, Yong-Ye Chang1, Hui-Jun Shi1, Min-Xin Guan2, Ming-Lian Zhang1

Foundation items:National Natural Science Foundation of China(No.31471191);Supporting Project for Science and Technology of Hebei Province (No.11276103D-12)

1Department of Combine Traditional Chinese and Western Medicine Ophthalmology, Hebeisheng Eye Hospital, Chinese Traditional Ophthalmology Institute of Hebei Province, Key Laboratory for Ophthalmology in Hebei, Xingtai 054001, Hebei Province, China;2Genetics Institute, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang Province, China

Correspondence to:Ming-Lian Zhang. Department of Combine Traditional Chinese and Western Medicine Ophthalmology, Hebeisheng Eye Hospital, Chinese Traditional Ophthalmology Institute of Hebei Province, Key Laboratory for Ophthalmology in Hebei, Xingtai 054001, Hebei Province, China. zhmlyk@sohu.com

Received：2015-11-30Accepted：2016-03-10

Abstract

•AIM:To estimate the prevalence and molecular epidemiology of Leber hereditary optic neuropathy(LHON)in the south of North China.

•METHODS:Patients suspected with LHON who went to Hebei Ophthalmic Hospital(formerly Xingtai Eye Hospital) from December 2001 to December 2014, were conducted mtDNA(mitochondrial DNA) screening. The patients whose origin were Xingtai, the sourth of North China, were screened out. The LHON families were given detailed follow-up, pedigree investigation and examinations of visual acuity, fundus, color vision, visual field and other clinical exam to diagnose the sick ones in the pedigrees. We took the resident population which date was from the sixth national census in 2010 in Xingtai area as the base, then conducted statistically analysis for those pedigrees to roughly estimate the incidence and molecular genetics characteristics of LHON in this area.

•RESULTS:From December 2001 to December 2014, the 463 people from four generations in 33 LHON families were investigated, and 72 patients were diagnosed as LHON, 65 males and 7 females. One patient was found with mutation at T3866C，60 at G11778A,8 at T14484C,2 at G11696A+G11778A, and 1 at G3460A. In the sixth national census in 2010, the population aged 0～64 in Xingtai area was 6592466, and the prevalence of LHON was 1.092/100000(95%CI:0.964～1.22/100000), and the incidence of G11778A, which was the most common one, was 0.91/100000(95%CI:0.79～1.03/100000).

•CONCLUSION:The incidence of LHON in Xingtai China is high, the lower limit of prevalence is about 1.092/100000, and the ND4 is the hot spot region. The mutation at G11778A is the most common one. Male patients were significantly more than female patients.

KEYWORDS:•Leber hereditary optic neuropathy;incidence rate;epidemiological investigation;gene mutation;mitochondria

Citation:Xie SP, Wang H, Chang YY,etal. Molecular epidemiology of Leber hereditary optic neuropathy in Xingtai China.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(4):738-741

摘要

关键词：Leber遗传性视神经病变；发病率；流行病学调查；基因突变；线粒体

引用：解世朋,王浩,常永业,等.中国邢台地区Leber遗传性视神经病变分子流行病学调查研究.国际眼科杂志2016;16(4):738-741

0引言

Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是眼科常见的一种线粒体DNA突变导致视网膜神经节细胞退行性病变的母系遗传性疾病。1871年，德国眼科医生Leber[1]首先报道了该病的临床特征，1988年Wallace等[2]首次发现该病与线粒体DNA(mitochondrial，mtDNA)MT-ND4基因的G11778A突变有关，90%～95%的患者只携带该病3个mtDNA原发突变(即G3460A、G11778A或T14484C)中的一个。近年来，国外报道携带三个原发位点的LHON患者发病率在1.36(芬兰北部)/10万～3.22/10万(英格兰东北部)[3-6]，欧洲的一项Meta分析提示其发病率为1∶45000[7]，T14484C视功能恢复较好，而G3460A、G11778A一般视功能恢复相对较差，男女性别比(6～12)∶1[3，8]。本病近年来在分子遗传学方面的研究取得较大进展，到目前为止，已经报道的与LHON发病有关的mtDNA有60多个(http://www.mitomap.org)，但在治疗方法及药物方面并没有大的突破。我国由于人口众多，人员流动性较强，对LHON进行流行病学调查相对困难，因此，探讨分析LHON患者在中国邢台地区的发病率有一定的临床意义。我们回顾性研究2001-12/2014-12在河北省眼科医院(原邢台市眼科医院)就诊具有ND4 G11778A、ND6 T14484C、ND1 G3460A线粒体DNA突变阳性的253例Leber遗传性视神经病变患者，筛选出邢台籍的LHON先证者33例，对这些先证者的4代母系成员进行了详细的家系调查和临床检查，得出中国邢台地区的LHON患者发病数据。

1对象和方法

1.1对象病例资料及入选标准：家系调查及进行临床检查前获得医院伦理委员会许可，征得所有患者及家属知情同意，对2001-12/2014-12就诊于河北省眼科医院(原邢台市眼科医院)符合以下入选标准的LHON患者进行研究。病例入选标准：(1)mtDNA检测ND4 G11778A、ND6 T14484C、ND1 G3460A至少一个位点突变阳性，或发现其它已报道与LHON相关的基因突变；(2)进行视野、视觉电生理、FFA等检查排除合并Best病、stargardt病、青光眼等引起视功能受损的其它眼病；(3)行头颅CT或MRI排除颅内疾患;(4)所有先证者均为邢台籍患者。

1.2方法对符合病例入选标准的LHON患者进行详细的家系调查，绘制出母系家系图，按图对所有母系成员进行性别、年龄登记，并进行视力、色觉、眼底、视觉电生理、荧光素眼底血管造影、自动静态视野等眼科检查，必要时行头颅CT排除颅内疾患，得出所有家系的基本资料及临床数据，筛选出LHON外显患者，并对这些家系成员进行随访，如有在研究期间发病者将实时更新观察数据。人口学资料根据我国2010-11-01零时为标准时点进行了第六次全国人口普查时邢台的0～65岁常住人口数为基数。

基因检测方法：所有入选病例均委托浙江大学进行mtDNA检测。抽取患者外周静脉血2mL，采用滤纸片法邮寄至浙江大学生命科学院。取1cm2的滤纸片放到1.5mL的离心管中，加入灭菌的DNA提取缓冲液500μL至离心管中，然后再加入30μL新鲜配制的蛋白酶K溶液，混匀，置于37℃水浴箱过夜。放入乙二胺四乙酸抗凝管中，采用酚一氯仿抽提法提取外周血白细胞DNA。应用Primer 3软件设计mtDNA目的片段引物，聚合酶链式反应(PCR)扩增片段。引物序列为17F(5’-TCACTCTCACTGCCCAAGAA-3’)、17R(5’-GGAGAATGGGGGATAGGTGT-3’)、21F(5’-GCATAATTAAACTTTACTTC-3’)。PCR反应体系为50μL∶25μL Taq Mix，上下游物各1μL、基因组DNA 80ng，加去离子水至50μL。PCR反应条件：95℃预变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，重复循环36次，最后72℃延伸10min。采用15g/L琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带，切胶回收，过柱纯化后由上海快基生物科技有限公司进行测序反应并进行测序结果分析。

2结果

2.1人口学资料邢台地区常住人口为7104114人，0～14岁的人口为1264133人，占总人口的17.80%；15～64岁的人口为5328333人，占75.00%；65岁及以上的人口为511648人，占7.20%。考虑LHON的发病特点、人口学特征及本次研究时间跨度较大的特点，我们截取2010年第六次人口调查数据中0～64岁的人口数6592466作为基数进行研究。

2.2家系情况与基因分布共有33例先证者，33个家系，共调查了这些家族的4代母系成员463例，出现视功能障碍的LHON患者72例,见表1。在这些家族中ND4 G11778A突变家系27个，外显男性55例，女性7例，年龄6～38(平均15.32±6.25)岁；ND6 T14484C突变家系3个，外显男性6例，年龄11～24(平均12.32±5.25)岁，ND1 G3460A突变家系1个，男性患者1例，年龄21岁。G11778A+G11696A突变家系1个，外显男性2例，发病年龄分别为13岁和21岁；3866家系1个，男性患者，发病年龄28岁。

2.3发病率在33个家系中共有72例外显的LHON患者视功能出现病理性损害，以2010年国家第六次人口普查时邢台地区0～64岁常住人口数6592466作为基数，计算出中国邢台地区Leber遗传性视神经病变患病率为1.092/10万(95%CI:0.964/10万～1.22/10万)，其中以G11778A位点突变最为常见，G11778A位点的发病率为0.91/10万(95%CI:0.79/10万～1.03/10万)；在这些患者中男女性别比为9.29∶1(65/7)，女性患者均表现为G11778A基因突变。

表1选取33个LHON家系情况

家系编号突变位点男性总数(例)发病男性(例)女性总数(例)发病女性(例)先证者发病年龄(岁)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

3讨论

通过本次调查我们发现LHON患者中最小的发病年龄仅为6岁，6～12岁儿童发病的LHON患者共有4例，20岁以后发病的成人5例，其余63例均为12～20岁发病，提示LHON可以在不同年龄段发病，青春期仍然是LHON发病较为集中的时期；家系调查中发现LHON患者大部分为农村患者(县级以下行政区域)，城市(县及县级以上行政区域)患者仅有3例，提示本病农村发病较高；在所调查的LHON发病患者中G11778A突变患者家系中男:女达到7.86∶1(55∶7)，而T14484C、G3460A、T3866C及G11778A+G11696A中共有10例患者，均为男性，提示LHON患者男性发病率明显高于女性，说明在邢台地区LHON患者发病男性明显多于女性，以农村患者居多，儿童和成人均可患病。2002年Chinnery 在英格兰东北部对2173800人群进行了第一次LHON的流行病学调查，结果显示LHON发病率为3.22/10万，基因携带者为11.82/10万[6]，而后来塞尔维亚及芬兰研究的LHON发病率在1.36(芬兰北部)/10万～2/10万之间[3-4]，另外欧洲进行的一项Meta分析显示LHON发病率为1/45000[7]。由于这些国家人口相对较少，医疗资源较为丰富，故进行流行病学调查容易控制。我国由于人口众多，近年流动人口增多，而且患者对遗传性疾病的认识不足，惧怕家族隐私泄露，配合较差，因此进行流行病学调查时困难较多。因为受人力、物力等条件的限制，我们暂时做不到对邢台地区的近700万人口进行彻底的流行病学调查。在近14a的临床工作中考虑到邢台地区属于经济欠发达地区，人口流动相对较少，而且河北省眼科医院(原邢台市眼科医院)有建院100余年的历史，在邢台地区有着较高的声誉，眼病患者外诊较少，大多会来该院就诊，LHON由于其遗传性特点，故通过对邢台籍的LHON先证者进行追溯，采用回顾性分析、家系调查、随访的形式，在这14a的时间中保持开放状态，随时更新家系情况，将出现的外显患者纳入研究数据库，对邢台地区的LHON发病率进行一个初步估测，从而得出该地区LHON发病率的大致情况。这种方法显然不是一种严谨的流行病学调查，研究过程中肯定会有遗漏，实际LHON的发病率要高于1.092/10万，所以我们得出的数据与英格兰的发病率有一定差距，但是应用这种方法至少可以得出LHON的发病率下限，对我国的LHON发病率情况有个大致了解。管敏鑫等对1281个中国LHON先证者进行线粒体基因检测后发现ND4片段G11778A突变占35.36%，ND6段T14484C突变占4.4%[9-10]；张铭连等[11]对66例LHON患者进行研究后发现T11778C位点突变占83.33%；T14484C位点突变占13．64%；而郭向明等[12]曾对140例LHON先证者进行mtDNA研究后发现G11778A位点突变占92.9%，T14484C位点突变占5.7%；我们分析以上研究结果数据差异较大的原因主要为管敏鑫研究领域主要为分子生物学，其研究对象为广义LHON患者，其目的是为了发现新的基因突变位点及发现LHON的致病机制，故病例入选标准较为宽松，而张铭连及郭向明所研究人群多有家族史为临床确诊病例，故筛选出的三个原发位点阳性率较高。我们曾对来院就诊的无家族史疑似LHON患者及30岁以后发病的LHON患者进行mtDNA分析，发现疑似患者中mtDNA突变阳性占47.3%,其中G11778A突变占36.6%,T14484C突变占4.5%,G3460A占1.8%与管敏鑫研究结果相近，而30岁以后发病的LHON患者中G11778A占77.8%[13-14]。在本次调查中，我们发现ND4为中国华北南部邢台地区LHON突变的热点区域，在三个原发位点突变中G11778A突变占有绝对优势，占所有LHON患者的86.11%(包括2例11696+11778患者)，人群中的发病率达到了0.91/10万(95%CI:0.79/10万～1.03/10万)，T14484C位点其次，占LHON患者的11.11%，而G3460A位点最少，仅有1例发病，占1.39%，在这些LHON患者中还发现了1例散发的3866位点突变患者。在治疗方面现代医学目前对LHON的治疗策略仍然有限，大多认为短链醌类化合物(如艾地苯醌)，在疾病的早期阶段对LHON患者的视力有保护作用，另外基因治疗虽然是一种很好的方法，但是仍然处于试验阶段[15-16]，我们下一步将进一步研究中西医结合治疗对LHON患者视功能干预的影响。

由于受条件限制的影响，本次研究尚有很多不足之处，我们将继续对这些家系进行随访，将新发现的邢台籍LHON患者纳入我们的研究数据库，继续本项研究，待条件成熟后，采用严谨的流行病学调查方法，对邢台地区进行一次科学的LHON流行病学调查，得出我国LHON较为客观的发病率。

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DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.4.39

收稿日期：2015-11-30 修回日期： 2016-03-10

通讯作者：张铭连，主任医师，教授，研究方向：眼底病.zhmlyk@sohu.com

作者简介：解世朋，硕士，副主任医师，研究方向：神经眼科。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.31471191);河北省科技支撑计划(No.11276103D-12)
作者单位：
1(054001)中国河北省邢台市，河北省眼科医院中西医结合眼科 河北省中医眼科研究所 河北省眼科学重点实验室；
2(310058)中国浙江省杭州市，浙江大学遗传学研究所

目的：初步估测Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)在中国邢台地区的发病率及分子流行病学特点。

方法：对2001-12/2014-12就诊于河北省眼科医院(原邢台市眼科医院)的可疑LHON患者进行mtDNA(mitochondrial DNA)检测，筛选出中国华北南部邢台籍的LHON患者，对这些LHON家系进行详细的随访、家系调查、视力、眼底、色觉、视野等相关临床检查，确诊出这些家系的患病人群，以2010年国家第六次人口普查时邢台地区常住人口为基数，对入组的LHON家系进行统计学分析，粗略地估算出邢台地区Leber遗传性视神经病变的发病率与分子遗传学特点。

结果：2001-12/2014-12期间调查了33个LHON家系的4代母系成员463例，确诊中国华北南部邢台籍Leber遗传性视神经病变患者72例，男65例，女7例。其中T3866C位点突变1例，G11778A位点突变60例，T14484C位点突变8例，G11696A+G11778A位点同时突变2例，G3460A突变1例。以2010年国家第六次人口普查时邢台地区0～64岁常住人口数6 592 466作为基数，计算出中国邢台地区Leber遗传性视神经病变患病率为1.092/10万(95%CI:0.964/10万～1.22/10万)，其中以G11778A位点突变最为常见，G11778A位点的发病率为0.91/10万(95%CI:0.79/10万～1.03/10万)。

结论：Leber遗传性视神经病变在中国邢台地区的发病率较高，其患病率的下限约为1.092/10万，其中ND4为突变热点区域，以G11778A位点突变最为常见，男性患者较女性患者明显多。