暗纹东方鲀Amhr2基因外显子9的SNP7271检测及其与性别相关分析

金　武，闻海波，杜兴伟，马学艳，顾若波，徐　跑

(1.农业部淡水渔业与种质资源利用重点实验室

中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡　214081；

2.南京农业大学渔业学院，江苏无锡　214182)



暗纹东方鲀Amhr2基因外显子9的SNP7271检测及其与性别相关分析

金武1,2，闻海波1，杜兴伟2，马学艳1，顾若波1，徐跑1,2

(1.农业部淡水渔业与种质资源利用重点实验室

中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡214081；

2.南京农业大学渔业学院，江苏无锡214182)

摘要：利用传统PCR和ABI 3730测序技术对暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)Amhr2基因外显子9进行了SNP7271检测和测序分析，并对该SNP位点与暗纹东方鲀性别相关性进行了研究。结果显示，在SNP7271位点发生了G/C碱基突变，产生了CG、CC两种基因型。SNP7271和暗纹东方鲀性别存在显著相关性(P<0.01)。基因型为CG的个体生理性别为雄性，基因型CC的个体生理性别为雌性。

关键词：Amhr2基因；暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)；性别决定；基因型

暗纹东方鲀(Takifuguobscures)体棕褐色，体侧下方黄色，腹面白色，其余体表可见白色狭纹或者白色斑点，因其肉质鲜美、营养丰富，与刀鱼、鲥并列“长江三鲜”[1]。随着暗纹东方鲀营养[2-3]、生长与发育[4-6]、生长影响因子，如温度[7]、盐度[2]以及疾病控制与健康养殖技术[8-9]等研究的广泛开展，特别是暗纹东方鲀控毒或无毒化处理的研究[10]，使之成为沿海养殖发展速度最快的品种之一，并从沿海向内地扩展，成为出口创汇、提高渔民养殖收入的重要品种。

Amhr2(antimüllerianhormonereceptortypeII)是穆勒氏激素通路中的一个重要因子，它的主要作用是调控哺乳动物和一些脊椎动物的繁殖器官的发育[11]，主要存在于细胞膜上，负责与配体结合[12]。对黑鲷[13]、青鳉[13]、矛尾鱼[14]的研究表明，雄性性腺中Amhr2基因表达量显著高于雌性。通过对一系列SNP标记和性别进行关联分析表明，Amhr2基因外显子9的一个编号为7271的SNP位点在东方鲀属3个种均存在，并具有唯一保守性，在SNP7271位点杂合子(C/G)为生理学雄性个体，纯合子(C/C)为生理学雌性个体[15]。但SNP7271在其他鱼类中尚未发现类似规律。同属东方鲀属的暗纹东方鲀的相关研究仍较少[16]，本研究通过传统PCR技术和ABI 3730测序技术对暗纹东方鲀Amhr2基因外显子9进行了SNP7271验证和测序分析，以期为养殖生产过程中筛选雄性个体提供技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

2014年7—10月，在江阴申港三鲜水产养殖有限公司选取同批养成的1龄成体暗纹东方鲀。通过解剖，肉眼观察暗纹东方鲀成体生理性别，雄鱼精巢呈乳白色，可挤出精液；雌鱼卵巢呈淡黄色，可见不同时期卵粒。共雌性47尾，雄性44尾，剪取肝脏组织，用75%乙醇保存。

1.2基因组DNA提取及引物设计

基因组DNA提取采用TaKaRa MiniBEST Universal基因组DNA提取试剂盒提取。引物设计在文献[15]报道的红鳍东方鲀Amhr2基因SNP7271上下游设计引物，引物序列为：Forward：5′-ACATCCAGATCTCCCACAGC-3′；Reverse：5′-TAAAACACG-CGTGAAAACCA -3′，扩增产物长度239 bp，引物由上海瀚宇生物工程有限公司合成。

1.3PCR扩增及序列测定

PCR反应体系为：DNA模板50 ng，体积1 μL；1×buffer，体积2 μL；Mg2+浓度为3 mmol/L，体积为0.6 μL；dNTP，浓度为2 mmol/L，体积为2 μL；Taq酶浓度为1 U，体积为0.2 μL；ddH2O 12.2 μL，引物浓度0.5 pM，体积为2 μL。PCR反应参数如下：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min 30 s，65 ℃延伸1 min，40个循环；65 ℃延伸10 min。

PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。紫外透射台上观察扩增结果，凝胶成像系统进行凝胶成像。PCR扩增产物序列由上海翼和应用生物技术有限公司进行纯化后测序。

1.4实验数据统计

λ2独立性检验计算公式：

Ei为理论值，Oi为实际观测值。因自由度df=1，因此进行连续性矫正。数据分析用R[17](2.15.2)软件进行2×2列双联表分析，进行Fisher精确检验。

2结果与分析

2.1PCR扩增

DNA提取试剂盒所提取的DNA经检测纯度较高，可用于PCR扩增。所设计的引物均能扩增出239 bp的特异性片段(图1)。

图1　暗纹东方鲀Amhr2基因外显子9 PCR扩增产物

1-16为样本编号，M是marker泳道，片段大小自下而上为100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp

2.2序列测定与分析

由图2测序结果可知，雄性个体在SNP7271处发生了碱基C/G非同义突变，雄性个体在该位点呈杂合子状态，雌性个体在该位点呈纯合子状态。

2.3Amhr2外显子9基因型与性别相关性分析

通过列2×2列联表，进行Fisher精确检验。结果表明，SNP7271和暗纹东方鲀性别之间存在显著相关性(P<0.001)。

图2　暗纹东方鲀Amhr2基因外显子9的

性别实际观察次数理论次数样本数PC/G杂合子雄性384747雌性1044C/C纯合子雄性9047雌性434444<0.001

3讨论

3.1SNP7271与东方鲀属性别相关性

暗纹东方鲀性别非生殖季节从外表不容易区分，在生殖季节可以通过测量形态学指标[18]、触摸腹部[19]、观察游泳姿势[20]等方法判定，但准确率仍不能达到100%，且需要长期经验积累，缺乏快速、高通量鉴别暗纹东方鲀性别的方法。

对红鳍东方鲀SNP7271性别相关SNP位点的研究表明，SNP7271和1龄红鳍东方鲀(孵化后271日龄)性别存在很高的相关性[21]。本研究表明，在暗纹东方鲀1龄成体中，SNP7271和性别存在显著相关性，可以为1龄暗纹东方鲀性别鉴定提供参考。

由于SNP7271雌雄差异仅为1个碱基，在对数目较多的个体大批量进行性别鉴定时，采用高分辨率熔解(High-resolution melting，HRM)法，通过PCR之后的熔解曲线分析快速、高通量地鉴别暗纹东方鲀性别[21]。部分专门用于HRM分析的仪器[22-24]甚至可以做到5 min完成96/384孔板PCR产物突变扫描或基因分型，且单个PCR产物检测成本较低。这些技术对于筛选单雄性暗纹东方鲀进行养殖生产具有重要意义，不仅节约了雌性个体消耗的饲料支出，特别是繁殖期间摄入能量物质均转化为不能食用的卵巢，而且提供市场优质、安全的精巢及精巢加工品，获得更高的经济效益。

3.2SNP7271检测性别准确性

用SNP7271来检测暗纹东方鲀准确性较高(雄性为80.9%，雌性为97.7%)。雌性基因型(C/C)个体误判为生理学雄性的可能原因是：(1)这9个样本卵巢发育慢或未发育，虽然进行性腺检查时剪破精巢进行观察是否有乳白色液体，但卵巢未发育，有可能将组织液误判为精液；(2)与红鳍东方鲀类似，暗纹东方鲀雄性性别的形成也可能受多个因素的影响，出现雌性基因型为C/C的生理学雄性个体[21]。SNP7271判断雌性个体时，仅1尾误判，因此在后续开展全雄暗纹东方鲀筛选时，可以通过排除雌体的方法提高群体雄性个体比例。

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(责任编辑：陈细华)

SNP7271 detection of exton 9 of Amhr2 gene and its associations with sex association in the Takifugu obscurus

JIN Wu1,2,WEN Hai-bo1,DU Xing-wei2,MA Xue-yan1,GU Ruo-bo1,XU Pao1,2

(1.KeyLaboratoryofFreshwaterFisheriesandGermplasmResourcesUtilization,MinistryofAgriculture/FreshwaterFisheriesResearchCenter,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuxi214081,Jiangsu,China;2.WuxiFisheriesCollege,NanjingAgricultureUniversity,Wuxi214182,Jiangsu,China)

Abstract：In order to identify gender of Takifugu obscurus before reproduction season and save the input of aquaculture of T.obscurus,SNP7271 of exton 9 of T.obscus Amhr2 gene were detected by PCR and DNA sequencing in present study.The correlation analysis between the polymorphism of Amhr2 and sex determination was studied.The results indicated that a G/C mutation at the position SNP7271 of the Amhr2 gene by sequencing and resulted in 2 genotype (GG,GC).There was significant correlation between SNP7271 and the gender of T.obscurus.The genotype CG was male and the genotype CC was female.

Key words：Amhr2 gene; Takifugu obscurus; sex determination;genotype

中图分类号：S917.4

文献标识码：A

文章编号：1000-6907-(2016)02-0099-04

作者简介：第一金武(1984-)，男，助理研究员，研究方向为水产养殖与水产动物遗传育种。E-mail:jinw@ffrc.cn通讯作者：徐跑。E-mail:xup@ffrc.cn

收稿日期：2014-03-21；

修订日期：2015-06-03

资助项目：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2013JBFR07)；江苏省水产三新工程项目(D2014-9)

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