利用psbA-trnH片段鉴定罗汉果和山药破壁草本

郑夏生， 赖智填，成金乐*　(.国家中医药管理局中药破壁草本技术与应用重点研究室，中山市中智药业集团有限公司，广东中山 528437；2.中国中医科学院中药研究所，北京 00700)



利用psbA-trnH片段鉴定罗汉果和山药破壁草本

郑夏生1，2， 赖智填1，成金乐1*(1.国家中医药管理局中药破壁草本技术与应用重点研究室，中山市中智药业集团有限公司，广东中山 528437；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

摘要[目的]解决罗汉果和山药破璧草本DNA提取困难，而无法用分子生物学鉴定的问题。[方法]通过比较常用DNA提取试剂盒法和改良的CTAB法，利用psbA-trnH片段鉴定罗汉果和山药破壁草本。[结果]改良的CTAB法可从罗汉果和山药的药材、破壁粉末和破壁草本3种形态中成功地提取出基因组DNA，并可进一步利用DNA条形码的psbA-trnH片段进行分子鉴定。[结论]该方法稳定可行，可用于罗汉果和山药的药材、破壁粉末和破壁草本的DNA条形码鉴别。

关键词罗汉果；山药；破壁草本；DNA条形码

Identification of Ultra-fine Granular Powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA bypsbA-trnHFragment

ZHENG Xia-sheng1,2,LAI Zhi-tian1,CHENG Jin-le1*

(1.The Key Laboratory of Technology of Breaking Cell Wall and Application in Chinese Medicine Decoction Pieces,Zhongshan Zhongzhi Pharmaceutical Group,Zhongshan,Guangdong 528437; 2.Institute of Chinese Materia Medica,Chinese Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700)

Abstract[Objective] To solve the problems of difficult extraction of DNA extraction from ultra-fine granular powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA.[Method] Ultra-fine granular powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA were identified bypsbA-trnHfragment by comparing the traditional DNA extraction kit and improved CTAB method.[Result] The improved CTAB method could successfully extract the medicinal materials,ultra-fine powders and ultra-fine herbs of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA.psbA-trnHfragment in DNA barcode was used for molecular identification.[Conclusion] This method is stable and feasible,and can be used for the DNA barcode identification of medicinal materials,ultra-fine powders and ultra-fine herbs of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA.

Key wordsSIRAITIAE FRUCTUS; DIOSCOREAE RHIZOMA; Ultra-fine granular power of Chinese Herbal Medicine; DNA barcode

草晶华破壁草本由广东省中药破壁粉粒工程技术研究开发中心(依托中山市中智药业集团有限公司)开发，是利用现代粉碎技术将传统中药饮片深加工成D90< 45 μm(300目以上)的粉体，再通过无固体添加成型技术制成的干燥颗粒状饮片(30～100目)[1]。与传统饮片相比，经过细胞破壁后破壁草本的有效物质溶出率更高[2-3]。破壁后药材的颗粒粒径非常小，失去了绝大多数的显微特征，增加了其物种鉴定的难度。

DNA条形码是通过基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的生物技术，具有快速、准确、重复性高等优点[4]。Chen等[5]通过对近万份药用植物样本进行DNA条形码筛选，提出一条药用植物基因鉴定思路，即以ITS2作为标准DNA条形码，以psbA-trnH作为辅助DNA条形码[6]。DNA条形码不仅可以从基因水平解决中药材与混伪品的物种识别问题，同时也可用于建立中药材二维DNA条形码流通监管体系，为中药材流通监管提供有力的技术支持[7]。

罗汉果为葫芦科植物罗汉果Siraitiagrosvenorii(Swingle.) C.Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang的干燥成熟果实。山药为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎。笔者所在课题组前期研究发现这2个品种的药材和破壁草本均无法按照常规的试验方法进行DNA条形码鉴别。原因可能是由于DNA提取困难，导致后续的PCR失败。笔者利用psbA-trnH片段鉴定罗汉果和山药破壁草本，克服了这2个品种的DNA提取困难，并成功进行后续的DNA条形码鉴别。

1材料与方法

1.1试验材料草晶华破壁草本均由中山市中智药业集团有限公司提供，详细信息见表1。中药饮片经过破壁处理后得到破壁粉末，再被制备成破壁草本(图1)。以上药材由中山市中智药业集团有限公司贾世清中药师鉴定，凭证标本保存于国家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室。

表1　样品信息

1.2试验方法

1.2.1样品前处理。①传统饮片：用灭菌的解剖刀切取约0.1 g，切碎，置于陶瓷研钵中，加入等量的PVP-40，用力研磨粉碎，称取0.1 g用于DNA提取。②破壁粉末：直接称取样品50 mg用于DNA提取。③破壁草本：分别称取各样品50 mg，置于2.0 mL离心管中，加入2颗Φ 5 mm的灭菌钢珠，用生物样品均质仪(爱施德，Bioprep-24)以6.0 m/s 振荡30 s，重复振荡2次，每次间隔30 s，使样品变成粉末状，即可用于DNA提取。

1.2.2DNA提取。①试剂盒法：按照新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(百泰克，DP3111)说明书操作。②改良CTAB法：向各样品管中加入800 μL CTAB free缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl)，剧烈振荡，旋转混匀5 min，13 000 r/min离心3 min，弃上清液；重复该步骤1～2次。向各样品管中加入800 μL CTAB缓冲液(3% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl)，充分振荡混匀，65 ℃金属浴中孵育3 h，期间每隔10 min左右颠倒混匀数下。加入600 μL氯仿-异戊醇(24∶1，V∶V)，充分振荡混匀，静置5 min，13 000 r/min离心15 min，小心吸取上清于新的1.5 mL离心管中。加入等体积-20 ℃预冷的异丙醇，-20 ℃放置10 min，13 000 r/min离心15 min，弃上清。加入800 μL -20 ℃预冷的75%乙醇，上下颠倒混匀数次，13 000 r/min离心15 min，重复1次。弃尽上清，打开离心管盖子室温晾干5 min，加入50 μL 65 ℃预热的ddH2O，小心吹打沉淀，将可溶部分转移至新的离心管中。取适量DNA用于质量检测，其余的置于-20 ℃保存，备用。

1.2.3DNA质量检测。取5 μL DNA，加45 μL ddH2O，混合均匀。以ddH2O为空白对照，用紫外分光光度计测定OD260和OD280，通过计算OD260/OD280评价DNA质量。

另取5 μL DNA，加1 μL 6 × DNA Loading buffer，混合均匀。用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带，评价DNA完整度。

1.2.4PCR扩增和测序。PCR反应体系：2 × PowerTaqPCR MasterMix(百泰克，PR1701)12.5 μL，正反向引物(psbA_F：GTTATGCATGAACGTAATGCTC，trnH_R：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O补足至25.0 μL。PCR反应程序：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s，52 ℃，20 s，72 ℃，50 s，35个循环；72 ℃，5 min。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域出现清晰条带的样品则送样测序。

图1　试验所用样品Fig.1　Sample used in this research

1.3数据处理利用CodonCode Aligner(版本：5.1.5.0)分析测序所得的原始峰图，拼接后去除低质量区和引物区。所得各样品的DNA序列分别在NCBI上进行BLASTN；在中药材DNA条形码鉴定系统(http://www.tcmbarcode.cn/china/index.php optionid=174)上进行比对，取同源性(Identity)最高的比对结果。2结果与分析

2.1DNA质量2种方法提取得到的DNA，经紫外分光光度计检测所得的吸光度比值见表2。由表2可知，试剂盒法提取的DNA质量较差，OD260/OD280均与理想值1.80～2.00相差较大；而改良CTAB法获得的DNA质量较好，OD260/OD280与理想值1.80～2.00 相差较小。

从电泳结果看，试剂盒法未见明显的DNA条带；而改良的CTAB法则可以获得清晰的DNA条带(图1)。综合紫外分光光度值与电泳结果，说明改良的CTAB法更适合用于提取罗汉果和山药的基因组DNA。

2.2序列比对结果PCR扩增后，改良CTAB法制备的样品可获得清晰的DNA条带，而试剂盒法制备的样品均为阴性(图3)。将阳性样品送检测序，发现6个样品均为阳性结果。说明改良的CTAB法用于提取罗汉果和山药的基因组DNA是可靠的。

3种形态的罗汉果样品经过PCR所得的psbA-trnH序列一致(均为173 bp)，与中药材DNA条形码鉴定系统和NCBI数据库中罗汉果Siraitiagrosvenorii的序列(登录号分别为：HAP00104和JN406966)同源性达100%(图4A)；3种形态山药样品的psbA-trnH序列也是一致的(均为208 bp)，与中药材DNA条形码鉴定系统中山药Dioscoreapolystachya的序列(登录号：HAP00148)同源性达100%，与NCBI数据库中山药的序列(登录号：JQ60354)同源性达99%(图4B)。表明psbA-trnH可用于罗汉果和山药中药破壁草本的物种鉴定。

表2　2种方法提取得到的DNA吸光度

图2　2种方法提取得到的DNA电泳结果Fig.2　Electrophoresis result of DNA extracted by two different methods

图3　PCR结果Fig.3　PCR results

注：A.罗汉果，B.山药。　Note：A was SIRAITIAE FRUCTUS and B was DIOSCOREAE RHIZOMA.图4　序列比对结果Fig.4　Results of sequence alignment

3结论与讨论

DNA条形码用于中药相关制品的物种鉴别，具有快速、高效的特点。该技术主要依靠对样品DNA条形码的成功扩增和测序，而前提是要获得足够量和达到一定纯度的基因组DNA。DNA提取是一门相对成熟的技术，目前已有许多DNA提取试剂盒被开发出来，用于不同类型样品的DNA提取。然而，这些试剂盒在植物DNA提取方面效果较差。因为植物种类纷繁复杂，且含有多酚和多糖等次生代谢产物，导致DNA提取困难甚至失败。中药材主要来源于植物，部分品种甚至经过高温处理等炮制，更加重了DNA提取的困难。CTAB法是常用的DNA提取方法，许多学者以该方法为基础，通过改良部分试验环节或试剂以获得适合于自身研究的物种[8-9]。

该研究采用的改良CTAB法主要有3处改进：①在药材粉碎环节采用PVP-40与样品一起研磨，一方面可以在未使用液氮的情况下增加样品的可研磨性，另一方面PVP-40可以与样品中的多酚、萜类物质起络合作用及与多糖结合[10]，在裂解过程中将这些杂质除去。②采用CTAB free缓冲液预处理研磨后的样品粉末[11]，除去色素等杂质。③将CTAB的浓度由2%提高至3%[12]，同时将裂解条件改进为65 ℃裂解3 h(试剂盒法为常温裂解10 min)，加强对样品细胞的裂解，以更大程度地获取DNA。由此可知，该研究所用的改良CTAB法可以获得纯度较高、量较多的DNA。

中药破壁草本是经过细胞破壁处理的一类新型饮片，由于失去绝大多数的细胞及组织显微特征，造成物种鉴定困难。特别是部分中药材，由于药材经过炮制，或者药材自身包含影响DNA提取的次生代谢产物，往往导致其DNA提取困难，而无法用于分子鉴定。DNA条形码技术近年来在中药鉴定方面的推广，为破壁草本等粉末或颗粒状中药制品的物种鉴定提供了技术参考。

参考文献

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中图分类号S 188

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)06-163-04

收稿日期2016-01-22

作者简介郑夏生(1987- )，男，广东揭阳人，博士，从事药用植物分子生物学研究。*通讯作者，教授，博士生导师，从事中药质量研究。