miR-1246在肝癌组织中的表达及其对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

彭兆意，周喜洋（浙江省天台县人民医院　普外科，浙江　台州　317200）



miR-1246在肝癌组织中的表达及其对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

彭兆意，周喜洋
（浙江省天台县人民医院普外科，浙江台州317200）

[摘 要]目的 观察微小RNA-1246（miR-1246）在肝癌组织中的表达及其对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响，探讨其在肝癌发生发展中的作用和意义。方法 应用实时定量PCR（qRT-PCR）方法检测miR-1246在肝癌以及癌旁组织的表达；对人肝癌细胞株（BEL7402、SMMC7721）转染miR-1246抑制剂后，采用MTT法观察肝癌细胞的增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 miR-1246在肝癌组织中表达显著高于癌旁组织[（65.39±8.77）vs（10.23±2.58），P=0.002]。MTT和凋亡实验结果显示，与阴性对照组相比，转染miR-1246抑制剂后，BEL7402细胞增殖能力下降，凋亡增加（P均＜0.05）；SMMC7721细胞也出现增殖能力下降，凋亡增加（P均＜0.05）。结论 miR-1246在肝癌组织中高表达，并且与肝癌细胞的增殖及凋亡有关，其表达的上调可能与肝癌的发生发展有关。

[关键词]微小RNA-1246；癌，肝细胞；增殖；凋亡

Expression of miR-1246 in human hepatocellular carcinoma and its effect on cell proliferation and apoptosis

PENG Zhao-yi,ZHOU Xi-yang.Department of General Surgery,People’s Hospital of Tiantai,Taizhou,Zhejiang 317200,China

Abstract objectiveTo observe the expression of miR-1246 in human hepatocellular carcinoma tissues and its effect on cell proliferation and apoptosis.MethodsThe expression of miR-1246 in hepatocellular carcinoma tissues and normal liver tissues was detected by real-time PCR(qRT-PCR).The cultured hepatocellular carcinoma cell line BEL7402 and SMMC7721 cells were transfected with miR-1246 inhibitor,the cell proliferation was detected by MTT assay and apoptosis was analyzed by flow cytometry.ResultsThe expression of miR-1246 in hepatocellular carcinoma tissues was significantly higher than that in normal liver tissues[(65.39±8.77)vs(10.23±2.58),P=0.002)].After transfected miR-1246 inhibitor,BEL7402 cell transfected hepatocellular carcinoma cells showed low proliferation rate and high apoptosis rate when compared with control group(P＜0.05),the same trend was also observed in SMMC7721 cells(P＜0.05).ConclusionThese results indicate that the miR-1246 is highly expressed in hepatocellular carcinoma tissues and its high expression may be involved in the development of hepatocellular carcinoma.

Key words microRNA 1246(miR-1246); hepatocellular carcinoma; proliferation; apoptosis

微小RNA（miRNAs）是一种小的非编码RNA，它能与靶mRNA的3′UTR结合，引起靶mRNA的降解或者抑制靶mRNA的翻译[1]。miRNAs作用十分广泛，多种生物过程的信号通路受其调控，如细胞增殖、凋亡、应激及脂肪代谢，在肿瘤发生发展上起着重要作用[2]，是目前生命科学领域研究的热点之一。已有研究证实，miR-1246的异常表达与多种肿瘤发生发展有关，如食管癌、胃癌、卵巢癌等，但其与肝癌的关系少有报道[3]。为探讨miR-1246在肝癌发生发展过程中发挥的作用，我们检测该小分子在临床肝癌组织以及癌旁组织中的差异表达情况，利用体外细胞学实验观察miR-1246对肝癌细胞的增殖和凋亡作用，为进一步探讨其在肝癌发生发展中的作用机制奠定研究基础。

1 材料和方法

1.1组织标本

收集我院2013年3月至2014年3月共35例肝癌患者手术切除的新鲜组织标本，其中男20例，女15例，年龄35～68岁，平均（54.1±6.3）岁。所有患者合并有慢性乙型肝炎病毒感染，术前血清甲胎蛋白（AFP）≥400 ng/mL，肿瘤组织病理类型为肝细胞癌，肿瘤BCLC分期均为A期。肝癌组织：取自实性癌中未坏死的区域。癌旁组织：肝癌周围2 cm以外的未坏死组织。所有患者术前未行放疗、化疗以及介入治疗。

1.2细胞株及试剂

人肝癌细胞株（BEL7402、SMMC7721）为浙一医院肝胆外科实验室馈赠。培养基R/MINI-1640购自Hycolone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司；Taqman microRNA assays购于美国ABI公司；Lipofectamine 2000、Trizol试剂、逆转录（RT）试剂盒购自Invitrogen公司；MTT购自美国Sigma公司；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。miR-1246抑制剂（5′-CCUGCUCC AAAAAUCCAUU-3′）和抑制剂对照（5′-UUGUACUACAC AAAAGUACUG-3′）购自上海吉玛公司。

1.3细胞培养及转染

两种人肝癌细胞株均用含10%胎牛血清的R/ MINI-1640培养液培养，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中。取对数生长期细胞，按脂质体试剂盒操作说明书进行转染，实验细胞分3组：抑制剂组（转染miR-1246抑制剂）、阴性对照组（转染miR-1246抑制剂对照）及空白对照组。

1.4qRT-PCR

收取细胞沉淀后直接用Trizol重悬，组织标本则加入1 mL Trizol后用匀浆器研磨，加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置10 min后，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，吸取上层水相加入等体积预冷的异丙醇置于-20 ℃ 30 min，再用12 000 r/min，4 ℃离心15 min后弃上清，用75%乙醇漂洗RNA沉淀，DEPC水溶解RNA沉淀。Nanodrop 1000（美国）检测总mRNA浓度。根据逆转录试剂盒操作，制备cDNA产物，以U6为内参，以逆转录产物为模板，在实时定量PCR仪（First7500美国）上进行PCR扩增。PCR扩增体系：10 μL 2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix、20 μmol/L的正反链引物各1 μL，4 μL逆转录产

2 结果

2.1肝癌组织中miR-1246的表达情况

通过RT-PCR技术分别检测肝癌组织和癌旁组织中miR-1246的表达，结果显示相对于癌旁组织（10.23± 2.58），肝癌组织（65.39±8.77）的miR-1246表达上调（P=0.002）。

2.2miR-1246抑制剂对肝癌细胞系增殖能力的影响

将BEL7402、SMMC7721细胞分别转染miR-1246抑制剂和miR-1246抑制剂对照，通过MTT比色法检测570 nm处不同转染处理后OD值，见表1。与阴性对照组和空白对照组比，BEL7402细胞株和SMMC7721细胞株转染抑制剂组OD值明显下降，差异有统计学意义（P ＜0.05），而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明抑制miR-1246后能够抑制肝癌细胞的增殖。物，加灭菌双蒸水至总反应体积20 μL。反应条件为：95 ℃预变性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ l0 s，共40个循环，采用相对定量方法计算靶miRNA相对表达量。

1.5MTT检测细胞增殖情况

将转染后的肝癌细胞接种于96孔板（5 000个细胞/孔）后继续培养，分别于24、48、72、96 h加入20 μL的MTT试剂（5 mg/L），在37 ℃恒温孵育箱中孵育4 h，吸出液体后加入150 μL二甲基亚砜（DMSO）溶解，在酶标仪570 nm波长处测定吸光度（OD）值。每组实验重复3次。

1.6流式细胞仪检测细胞凋亡情况

将转染后24 h后的肝癌细胞更换为无血清培养基，置于1% CO2，37 ℃培养箱继续培养48 h。收集细胞后加入5 μL Annexin V和5 μL PI，混匀，室温下避光孵育30 min，然后送流式细胞仪（美国BD公司）检测。每组实验重复3次。

1.7统计学分析

表1　转染72 h后各组细胞的OD值比较

2.3miR-1246抑制剂对肝癌细胞系凋亡的影响

流式细胞仪检测结果如图1、表1所示，与阴性对照组和空白对照组比，BEL7402细胞株和SMMC7721细胞株转染抑制剂组凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明抑制miR-1246能促进肝癌细胞凋亡。

图1　BEL7402细胞株凋亡图

表2　各组细胞凋亡率（%，Q2+Q4）的比较

3 讨论

原发性肝细胞癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率仅次于食管癌和胃癌之后位于第三位，而且在癌症导致死亡中高居第三位[4]。miRNAs已被证实广泛参与体内多种生理或病理生理过程，包括肿瘤的发生发展在内。miRNAs可以通过调节其靶mRNA的表达，发挥促进或者抑制肿瘤进展的作用[5-7]。大量的研究已经证实，原发性肝癌组织中可以检测到许多特异性的miRNAs分子，其中就包括miR-1246，由于其是转录后水平调控基因表达的关键因子，因此研究该小分子在肝癌发生发展中的作用，对更加深入了解肝癌的发病机制以及新的抗癌药物的研发具有重要意义[8-10]。miR-1246为众多小分子RNA中的一员，在多种疾病及生理过程中均发挥重要作用。日本学者Takeshita等利用microRNA芯片筛选技术对食管鳞癌的患者血清与正常人血清行miRNAs芯片筛选，发现miR-1246表达上调，并且发现miR-1246的表达上调与临床病理特征相关，可以作为食管鳞癌的一个诊断和预后指标[11]，还有报道显示miR-1246可作为卵巢癌患者预后指标[12]。

我们的研究结果显示，肝癌组织中miR-1246的表达显著高于癌旁组织，提示与肿瘤发生发展有关；体外细胞实验发现抑制miR-1246后肝癌细胞增殖能力下降，凋亡增多，提示该小分子RNA与肿瘤细胞的增殖、凋亡紧密相关。这与陈军莹等[13]的研究结果一致。关于miR-1246的靶基因，目前尚未明确，有报道其是p53家族的靶基因，当细胞受到损伤时，p53基因诱导miR-1246的表达，下调Dyrkla A（一种唐氏综合征相关的蛋白激酶）的基因表达，从而使其底物NFATcl的表达增加，导致细胞凋亡减少，在敲除p53基因则可起到相反的作用，这提示着p53基因可以通过miR-1246而发挥抑制肿瘤的作用，miR-1246可能与肿瘤的发生相关[14-15]。miR-1246的功能可能还涉及其他靶基因或信号途径的作用，需要进一步研究。

通过本研究，我们发现了miR-1246在肝癌组织中表达增高，且与肝癌细胞的增殖、凋亡有关，提示该小分子RNA在肝细胞癌的发生发展过程中起着正调控的作用，它可能作为肝细胞癌恶性行为的重要标志，同时也可能为治疗及预后提供参考，关于该小分子在肝癌的分级分期中的意义及与预后的关系值得进一步研究。

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（本文编辑：张和，鲁翠涛）

作者简介][第一彭兆意（1973-），男，江西吉安人，主治医师，硕士。

[基金项目]浙江省台州市科技项目（100KY-58）。

[收稿日期]2015-07-17

[中图分类号]R735.7

[文献标识码]A

doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.02.003