附子生物碱脱毒前后对小菜蛾室内毒力活性比较研究

2016-04-23白雪康晓慧杨随庄等

湖南师范大学学报·自然科学版 2016年2期

白雪　康晓慧　杨随庄等

摘要通过对附子生物碱进行脱毒处理，将双酯型附子生物碱水解为单酯型附子生物碱，分别测定了脱毒前后附子生物碱对小菜蛾的室内毒力活性，包括拒食活性、胃毒活性和生长抑制活性.拒食活性中，非选择性拒食率脱毒前后的毒力回归曲线分别为y=-3.312+2.014X， y=-1.666+1.716X，AFC50分别为0.651和0.971 g/L.选择性拒食率的毒力回归曲线分别为y=-0.859+1.141X，y=-1.718+1.431X，AFC50为0.753和1.201 g/L.胃毒活性中，死亡率的毒力回归曲线分别为y=-1.296+1.838X， y=-1.386+1.379X， LC50分别为0.705和1005 g/L.生长抑制活性中，生长抑制率的毒力回归曲线分别为y=-1.283+1.73X， y=-1.24+1.316X， AGC50分别为0.742和0.942 g/L.分析以上三种活性可知，脱毒前附子生物碱对小菜蛾的杀虫活性主要体现在拒食活性上，其次为生长抑制活性和胃毒活性；脱毒后杀虫活性有所降低，但未全部丧失，尤其在拒食活性上表现明显.

关键词附子生物碱；小菜蛾；毒力回归曲线

中图分类号 S435.654文献标识码 A文章编号 10002537（2016）02002906

Comparative Study on the Toxicity Activity to Plutella Xylostella by

Aconite Alkaloids Both before and after Detoxification in Laboratory

BAI Xue1， KANG Xiaohui1*， YANG Suizhuang1， YUAN Xiaohong1， ZHOU Qiang2

（1.College of Life Science and Engineering， Southwest University of Science and Technology， Mianyang 621010， China；

2.Agricultural Service Center of Yongming Town， Mianyang 621038， China）

Abstract Based on the detoxification treatment， making the double ester type of aconite alkaloids hydrolyzed single ester type， we have determined the antifeedant activity， stomach toxicity and growth inhibitory activity by the aconite alkaloids before and after partial detoxification. For the antifeedant activity， the regression curve of the non selective antifeedant rate before and after detoxification is y=-3.312+2.014X， y=-1.666+1.716X， with AFC50 equal to 0.651 and 0.971 g/L， respectively. The regression curve of the selective antifeedant rate is y=-0.859+1.141X， y=-1.718+1.431X， with AFC50 0.753 and 1.201 g/L， respectively. For the gastric toxicity， the regression curve of mortality is y=-1.296+1.838X， y=-1.386+1.379X， with LC50 as 0.705 and 1.005 g/L， respectively. For the growth inhibition activity， the growth inhibition rate of the regression curve is y=-1.283+1.73X， y=-1.24+1.316X， with AGC50 to be 0.742 and 0942 g/L， respectively. It can be seen from above results about the three kinds of activity that aconite alkaloids has a strong insecticidal effect before detoxification， which is mainly reflected by the antifeedant inhibition followed by the gastric toxicity. The activity is markedly reduced after detoxification， though not all of it is completely diminished， especially for the antifeedant activity.

Key words aconite alkaloids； Plutella xylostella； toxicity regression curve

附子为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaeli Debx.），其活性成分含生物碱，具有很强的药理作用.很多学者对附子进行了研究，大多集中在对附子生物碱的提取及其成分分析上，而对其应用价值鲜见研究.刘倩等[1]采用单因素实验筛选出了最佳的TLC条件，完善了附子生物碱的TLC检查方法；杨洁红等[2]将附子生物碱同甘草的活性物质结合，对两者结合所产生的抗炎作用机制进行了探讨；陈平等[3]采用液相色谱质谱的方法对附子生物碱的煎煮减毒机理进行了研究；杨昌林等[4]利用蒸制和烘制两种方法对附子生物碱的成分含量进行了系统研究.

小菜蛾是十字花科蔬菜主要害虫之一，因其易产生抗药性及耐药性，成为了目前许多学者研究热点之一.罗雁婕等[5]对云南省及国内外小菜蛾抗药性的研究概况进行了系统分析；邢静等[6]采用叶片药膜法，探讨了亚致死浓度氯虫苯甲酰胺对小菜蛾解毒酶活性和药剂敏感的影响；程英等[7]选取贵阳、安顺及遵义作为试验点，就小菜蛾田间种群对杀虫剂的抗药性进行了监测；刘玉娣等[8]测定了不同虫龄小菜蛾过氧化氢酶、过氧化物酶与耐药性之间的关系.此外，很多学者还将研究重点放在了防治措施上面.李振宇等[9]对比了不同性诱剂诱芯对小菜蛾的引诱效果；孔国顺等[10]选取了8种生物农药对小菜蛾进行了药效实验，在实验基础上筛选出了较为有效的生物农药；鲁喜荣等[11]选取了克蛾宝、锐农丹等6种乳油制剂对小菜蛾进行田间防控，对每种农药的药效作用进行了分析；陆信任等[12]研究了15%的茚虫威乳油对小菜蛾的防治效果.

本文选择小菜蛾作为实验对象，采用附子生物碱作为防治药剂，其主要成分为乌头类生物碱，结构可分为单酯型和双酯型[13]，由于双酯型生物碱毒性较大，在实际应用中受到了很多限制，基于此，本文将双酯型生物碱转变为单酯型生物碱，比较了脱毒前后附子生物碱对小菜蛾室内毒力活性的变化，并对其作用机理进行了初步分析，这对附子生物碱的实际应用具有一定的推广价值，并且能为植物源农药的开发提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试虫源源于四川省绵阳市三台县永明镇油菜示范基地，于西南科技大学东七实验楼进行饲养.饲养条件为室温25 ℃，相对湿度70%，L/D=14/10，幼虫饲养油菜幼苗，成虫饲养20%的蜂蜜水，实验期间选取2～3龄期健康幼虫进行实验.

1.2 附子生物碱的制备

附子于2014年8月采于四川省绵阳市江油县，自然晾干后用粉碎机粉碎为干粉，用95%乙醇提取8 h，用旋蒸仪蒸发至膏状，放入深色广口瓶中置于4 ℃下保存备用.将供试提取物用蒸馏水加热溶解，分为0.1，0.3，0.5，0.8，1.0 g/L 5个梯度浓度.

1.3 附子生物碱的脱毒

将提取物加入到1，4二氧六环和水的混合液（体积比9∶1）中，在95 ℃下利用水浴加热回流约10 h，即可将双酯型生物碱转化为单酯型.

1.4 实验方法

1.4.1 附子生物碱脱毒前后对小菜蛾幼虫的拒食活性参照Ismail等[14]的方法，，将洁净的甘蓝叶制成2×3 cm2大小，分别于配好的药液中浸置10 s，通风处自然阴干，用蒸馏水作对照.将晾干的叶片放入直径70 cm 的培养皿，接入大小一致的3龄幼虫，每个处理3组重复，每组重复10 头试虫，转入恒温培养箱中饲养，饲养温度为（25±1）℃，相对湿度60%～70%，光暗周期比L/D=16/8. 24 h后用坐标纸测量其取食面积，计算出拒食率.计算公式如下：

选择性拒食率（%）=（对照组取食量-处理组取食量）/（对照组取食量+处理组取食量）×100，

非选择性拒食率（%）=（对照取食量-处理取食量）/对照取食量×100.

1.4.2 附子生物碱脱毒前后对小菜蛾幼虫的胃毒活性参照1.4.1的方法在培养皿中接入事先饥饿了2 h的生长一致的2龄幼虫，每天更新叶片，记录死亡虫数，24 h记录一次，连续记录7天.计算其死亡率：死亡率（%）=死亡虫数/总头数×100.

1.4.3 附子生物碱脱毒前后对小菜蛾幼虫的生长抑制活性参照1.4.1的方法将2龄幼虫接入培养皿前，对每头幼虫称取体质量.每天称一次，并更换新处理叶片，坚持记录7 d.死虫不称体质量.计算生长发育抑制率.

体质量增长率（%）=（处理后体质量-处理前体质量）/处理前体质量×100，

生长发育抑制率（%）=（对照体质量增长率-处理体质量增长率）/对照体质量增长率×100.

1.5 数据处理

用EXCLE 2015对数据进行系统处理，SPSS 21.0进行显著性分析和回归分析.

2 结果与分析

2.1 附子生物碱脱毒前后对小菜蛾幼虫的拒食活性

从非选择拒食率可知，脱毒前各浓度间拒食率均呈显著性差异，处理浓度加大，拒食率明显升高，最高达到76%，这表明高浓度下附子生物碱对小菜蛾具有较强的非选择性拒食活性；脱毒后，当浓度加大到0.5 g/L时，各浓度开始出现显著性差异，拒食率虽然较脱毒前有所降低，但最高达到53%.对于选择性拒食率，脱毒前后各浓度间差异不如非选择性拒食率明显，选择性拒食率在未脱毒前最高为59%，相比非选择性拒食率有所降低.这表明附子生物碱对小菜蛾的拒食活性无论是在脱毒前还是脱毒后，非选择性拒食活性都高于选择性拒食活性.结合两者的毒力回归曲线分析，脱毒前的拒食中浓度都低于脱毒后的拒食中浓度，非选择性拒食中浓度低于选择性拒食中浓度.非选择性拒食率脱毒前后的回归曲线分别为y=-3.312+2014X， y=-1.666+1.716X，非选择拒食中浓度分别为0.651和0.971 g/L.选择性拒食率回归曲线分别为y=-0.859+1.141X， y=-1.718+1.431X，选择性拒食中浓度为0.753和1.201 g/L.具体见表1和表2.

2.2 附子生物碱脱毒前后分别对小菜蛾的胃毒作用

对7天内小菜蛾的死亡率进行分析，死亡率最高为63%，整体死亡率偏低，表明附子生物碱对小菜蛾的胃毒作用不明显.单独分析脱毒前，处理前期，各浓度间的死亡率显著性差异不明显，第五天开始，浓度达到0.8 g/L的幼虫死亡率超过了50%，并且与其他浓度间呈现显著性差异.脱毒后，附子生物碱对小菜蛾的胃毒活性明显降低，低浓度下小菜蛾从第五天开始才出现少量死亡，并且死亡率普遍未超过50%.对第七天小菜蛾的死亡情况进行回归分析，其毒力回归曲线分别为y=-1.296+1.838X， y=-1.386+1.379X，脱毒后小菜蛾的死亡率相比脱毒前变化趋势缓慢.半致死浓度分别为0.705和1005 g/L.脱毒后的LC50超过了1 g/L，表明脱毒后的附子生物碱对小菜蛾的胃毒作用明显减弱，见表3～表5.

2.3 附子生物碱脱毒前后分别对小菜蛾的生长抑制作用

结合表6和表7分析，附子生物碱对小菜蛾体质量增长有一定的抑制作用.脱毒前，前两天各浓度之间的抑制率不显著.从第四天起，高浓度与低浓度开始呈现出显著性差异，拒食率也逐渐增大.第七天，当浓度为0.8和1.0 g/L时，生长抑制率分别达到54.7%和67.6%.脱毒后，小菜蛾幼虫的生长抑制率有所降低，各浓度下的生长抑制率显著性不如脱毒前明显，在第六天和第七天时，高浓度（大于0.5 g/L）与低浓度呈现出了一定差异性，生长抑制率最高为52.22%，脱毒前附子生物碱对小菜蛾幼虫生长抑制中浓度为0.742 g/L，明显低于脱毒后的0.942 g/L.毒力回归曲线分别为y=-1.283+1.73X， y=-1.24+1.316X.

3 小结与讨论

化学药剂的无限制施用导致小菜蛾的抗药性不断多元化，而小菜蛾一旦对一种农药产生抗药性以后，也会对其他未使用过的农药产生交互的抗性[15].本文选取的生物碱来源于附子，已有很多文献报道过其具有拒食、触杀、生长发育抑制、降低适应能力、降低生殖力等多种生物活性，正是由于其多种特异活性从而使得害虫很难产生抗药性[16].同样，附子生物碱结构中的双酯型生物碱也被一些文献证明其具有一定毒性，可能会对人体造成影响.本文据此对供试药剂进行了脱毒处理，将双酯型生物碱水解为单酯型生物碱，分别对照了附子生物碱脱毒前后对小菜蛾的拒食活性、胃毒活性及生长抑制活性.

实验结果表明，3种活性中拒食活性最高，脱毒前非选择性拒食率和选择性拒食率最高分别达到76%和59%，而且在此过程中出现了幼虫死亡现象，这可能是因为无法进食而导致的.而在脱毒后，两者拒食率有所降低，分别为53%和36%，这表明对附子生物碱进行脱毒后，仍然对小菜蛾具有一定的拒食活性，并且其效果主要体现在非选择性拒食率上.脱毒前后非选择性拒食率的独立回归曲线分别为y=-3.312+2014X， y=-1.666+1.716X，AFC50分别为0.651和0.971 g/L.选择性拒食率回归曲线分别为y=-0.859+1.141X，y=-1.718+1.431X，AFC50分别为0.753和1.201 g/L.

对胃毒作用进行分析，未脱毒时，小菜蛾幼虫死亡率最高仅达到63%，并且是在最高浓度施用第7天时所呈现的效果，其他时间死亡率普遍偏低.而脱毒后死亡率大幅降低，基本未超过50%.这表明附子生物碱对小菜蛾的胃毒作用微效而且缓慢.脱毒前后的毒力回归曲线分别为y=-1.296+1.838X， y=-1386+1.379X，半致死浓度在脱毒前后普遍偏高，分别为0.705和1.005 g/L，这表明附子生物碱对小菜蛾的胃毒作用不太明显.

对生长抑制作用进行分析，实验前期，各浓度生长抑制率间显著性差异表现不明显，生长抑制率普遍偏低，但从第四天开始，高浓度与低浓度间呈现出一定差异性，脱毒前生长抑制率最高为67.79%，脱毒后最高为52.22%，这表明附子生物碱对小菜蛾具有一定的生长抑制活性.脱毒前后死亡率的毒力回归曲线分别为y=-1.283+1.73X， y=-1.24+1.316X， AGC50分别为0.742和0.942 g/L.

综合以上分析结果，附子生物碱脱毒前对小菜蛾具有较强的杀虫活性，且主要体现在拒食活性上，拒食活性中非选择拒食活性高于选择性拒食活性，其次为生长抑制活性，胃毒活性最弱.在拒食活性中，介于本文只测定了24 h的拒食面积，若测定48 h甚至72 h的拒食，其拒食效果还有待研究.而将双酯型生物碱水解为单酯型生物碱后，杀虫活性有所减弱，但从拒食活性和生长抑制活性中可知，脱毒后的拒食率和生长抑制率均超过了50%，这表明脱毒后的生物碱在一定浓度下可以进一步利用.

从3种活性的实验效果可以看出，附子生物碱对小菜蛾的作用方式是间接性的，主要是通过幼虫接触药剂后产生拒食反应，减少取食甚至停止进食，迫使其生长发育得到抑制，最后导致死亡.本研究由于条件限制，只在室内进行了实验，若要将附子生物碱真正推广到实际应用中，还需利用田间试验进一步探究不同大田气候环境下附子生物碱对小菜蛾的施用效果，在进行大田实验时，可考虑将其与化学农药复合或者交替施用，充分发挥两者的优势作用，降低防治成本，延缓小菜蛾产生抗药性.

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