一种测试鳞翅目幼虫嗅觉行为的高效选择装置

俞佳宁 束长龙 田小燕 张杰

摘要 昆虫的寄主定位、产卵选择、聚集、求偶等行为受到来自昆虫周围环境的挥发性气味化合物的影响和调控。研究挥发物对昆虫行为的影响作用主要采用Y形嗅觉仪等行为检测装置，而研究挥发物对鳞翅目幼虫的影响作用却缺乏专业、高效的装置。本研究设计制作了研究鳞翅目幼虫行为的高效选择装置，适用于高效筛选对鳞翅目幼虫具有引诱、驱避等作用的挥发物。小菜蛾3龄幼虫的行为选择测试结果表明，对小菜蛾幼虫引诱最强的植物为大白菜，其次是油菜和甘蓝;花生叶片对小菜蛾幼虫没有作用;而番茄叶片对小菜蛾幼虫则具有驱避作用。由此说明该装置可以有效测定小菜蛾幼虫对不同挥发物的反应，将为挥发物对昆虫行为的影响研究、进而筛选新的化合物来控制虫害提供新的技术支持。

关键词 小菜蛾;选择装置;嗅觉;挥发物

中图分类号： Q968.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021121

Abstract The behaviors of insect including host location， oviposition selection， aggregation and courtship are all regulated by the volatile compounds from the environment. The Y-tube olfactometer and other olfactometers are mainly used to study the effects of volatiles on the behavior of insects， but few professional and efficient devices for studying the effects of volatiles on lepidopteran larvae are available. In this study， an efficient selection device for studying the behavior of lepidopteran larvae was designed， which is suitable for efficient screening of volatile compounds with attractant and repellent effects on lepidopteran larvae. The results of behavioral selection test using the third-instar larvae of the diamondback moth Plutella xylostella showed that Chinese cabbage had the strongest attraction to the larvae in all of the samples we tested， followed by rape and cabbage. Meanwhile， peanut leaves showed no effect on diamondback moth larvae， while tomato leaves had a repellent effect on diamondback moth larvae. These results indicated that this device could effectively measure and distinguish the behavioral response of diamondback moth larvae to different volatiles. This device provides a new technical support for studying the effects of volatiles on insect behaviors and screening new compounds to control insect pests.

Key words Plutella xylostella;selection device;olfaction;volatile compounds

昆虫在不同的发育阶段，灵敏的嗅觉感受系统可以接受来自周围环境中的各种化學信息素，帮助昆虫进行寄主定位，求偶，选择产卵场所，寻找合适的栖息地等[1-4]。例如，小菜蛾成虫能够依靠十字花科作物释放的芥子油即异硫氰酸酯类挥发物对寄主进行定位[5];而桉树和针叶树释放的萜烯类物质则会对小菜蛾性信息素释放和响应产生不利影响[6]。对昆虫嗅觉行为的研究可为害虫发生、为害机制解析奠定基础，并为害虫预测预报和绿色防控提供新的思路和手段。

Y形嗅觉仪是测定昆虫行为反应中最为常见的装置，它的出现极大地推进了昆虫行为的研究。但该装置也存在着一些问题，首先，Y形嗅觉仪的主臂活动空间小，不适合测定非常活跃的昆虫;其次，来自两侧臂管的气味极易在与主臂的交叉处发生混合，对于昆虫做出正确的选择造成较大的干扰;第三，在实际的操作过程中，一次只能引入一头试虫，在面对大量的化合物筛选时效率低下，影响试验进度;第四，Y形嗅觉仪在工作期间需要进行实时观察，消耗大量时间成本。为了测定不同种类昆虫的行为反应，研究者对Y形嗅觉仪进行了相应的改进。由Y形嗅觉仪改进的四臂嗅觉仪，适合测定各种小型的昆虫（例如蚜虫、膜翅目寄生蜂和螨类等），弥补了不能同时测定多种气味源、气味源混合的缺点[7-8]。肖春等[9]在测定棉铃虫对植物气味的反应中，考虑到棉铃虫的个体大、飞行能力强、需要较大的活动空间，结合Y形嗅觉仪以及风洞的特点，自主设计了选择嗅觉仪。该嗅觉仪包含一个0.8 m ×0.5 m的生测笼，便于棉铃虫自由活动，满足了棉铃虫在自然状态下根据挥发物形成的浓度梯度来确定飞行的方向。用于测定鳞翅目幼虫的选择性嗅觉装置报道较少，一般多使用Y形嗅觉仪或者四臂嗅觉仪进行测定，但这些装置除了存在测定幼虫数量少、效率低等问题，Y形嗅觉仪中主臂离气味源有一定的距离，而鳞翅目的幼虫只能在短距离范围内识别气味，当气味源距离被测试虫较远时，气味浓度可能过低无法引诱幼虫[10]。目前在测定幼虫取食选择时多采用平皿法[11]，但平皿装置内部的气体流动性不好，不利于测定昆虫的嗅觉反应。C7C46967-FEBA-473C-8AAF-0FC956033F0D

小菜蛾 Plutella xylostella（Linnaeus）属鳞翅目菜蛾科，是一种世界性害虫，主要为害甘蓝、白菜、花椰菜等十字花科植物，全年用于防治小菜蛾的费用高达40亿美元[12-13]。目前，昆虫信息素用于农林害虫防治已有诸多成功范例，在害虫防治中具有广阔的应用前景[14-17]。因此，挖掘天然、高效的化学信息物质对于害虫绿色防控具有重要意义。为了能够高效筛选对幼虫具有引诱、驱避作用的新型化学信息物质，急需开发新的装置来满足研究工作的要求。本文以重要的农业害虫小菜蛾为试虫，设计、制作了一种高效、高选择性测定鳞翅目幼虫嗅觉行为反应的装置，能够准确测定幼虫对气味物质的行为反应，该装置将为新型化学信息物质的筛选和幼虫行为研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试虫源：小菜蛾为本实验室在室内多年饲养种群，人工气候箱条件为温度（25±1）℃、相对湿度（70±5）%、光周期L∥D=16 h∥8 h。

供试蔬菜品种：3种小菜蛾寄主植物十字花科蔬菜，分别为大白菜Brassica pekinensis、油菜B.napus、甘蓝B.oleracea，均购自超市;非寄主植物为番茄Lycopersicon esculentum，品种为‘中蔬4号;花生Arachis hypogaea，品种为‘天府3号，种子来源于中国农业科学院。番茄和花生葉片均取自盆栽成株。

仪器：玻璃转子流量计，沈阳北星仪表制造有限公司;静音无油空气压缩机（DA5001/9），江苏贷洛医疗科技有限公司。

1.2 幼虫高效选择装置的设计

基于Y形嗅觉仪的原理，本实验室自行设计了高效选择装置。整个装置大小为21 cm× 21 cm ×4 cm，由有机玻璃制成（见图1），分为三个部分：试虫选择区、陷阱区和选择孔。有机玻璃板厚度为1 cm，试虫选择区大小为长21 cm×宽10 cm ×高1 cm，两个陷阱区大小为10 cm× 10 cm ×4 cm，选择孔直径为7 mm，相距1.5 cm。在试虫选择区和陷阱区的外侧分别有两个出气孔和进气孔（直径为7 mm），用于插入1 mL枪头，陷阱区的蓝色枪头与硅胶管相连，然后依次连接到流量计、蒸馏水加湿瓶、活性炭空气过滤装置和空气压缩机。试虫在感受到气味物质后做出相应的行为反应，如果气味物质对试虫具有引诱作用，试虫会逆气流方向进入陷阱区;如果气味物质对试虫具有驱避效果，试虫则会表现出明显逃避进入另一陷阱区或者不发生选择;如果气味物质对试虫表现中性，试虫不会表现出明显的驱避或者引诱现象。使用本装置进行研究只需要在测试结束后对各陷阱区和试虫选择区的试虫数进行统计。

1.3 幼虫高效选择装置的功能验证

挑选健康、活跃的小菜蛾3龄幼虫30头，放入直径9 cm的培养皿中饥饿30 min。

根据小菜蛾的食性，将寄主植物十字花科蔬菜（大白菜、甘蓝和油菜）作为引诱组，非寄主植物花生为中性对照组，番茄为驱避组。

称取新鲜的大白菜、甘蓝、油菜、花生以及番茄叶各5 g，均机械破碎放入直径9 cm的培养皿中，按照表1的组合进行行为学试验。依次在试虫选择区放入试虫和在陷阱区放入测试的材料后，打开空气压缩机，设置气流大小为200 mL/min，2 h后对陷阱区以及试虫选择区的虫数进行统计。整个试验过程均在黑暗环境下进行，消除光照对小菜蛾幼虫行为选择的影响。每次测试完成后用无水乙醇、清水依次洗涤装置并晾干，以减少处理组之间的气味残留。同时，在进行下一轮测试时，交换样品的位置以消除误差。

1.4 数据处理

分别统计试虫选择区以及两个陷阱区的试虫数量，计算“平均值±标准误”、吸引指数和反应率，并用双尾t测验比较其差异显著性。

反应百分率公式：

吸引指数=（处理组内的虫数-对照组内的虫数）/测试总虫数;

反应率=（处理组内的虫数+对照组内的虫数）/测试总虫数×100%。

2 结果与分析

2.1 幼虫高效选择装置设计、制作与特点

幼虫高效选择装置最大的优势在于可以实现无人值守、高效地进行化学信息物质的筛选。鳞翅目的幼虫只能在短距离范围内通过气味识别食物，当气味源离被测试幼虫距离较远时，气味源的浓度可能被稀释无法引诱幼虫[10]，故设计装置时将试虫选择区与陷阱区紧相邻（中间只有1 cm厚度的隔板，详见图1）。由于小菜蛾幼虫生性活泼，易受惊扰，宽阔的试虫选择区则能保证幼虫充分的活动空间，避免幼虫误入陷阱区;而且可以一次性放入多头试虫，大大提高了试验的效率。两个陷阱区用于捕获试虫以及直接放置气味样品，若供试样品为完整植株等个体较大的物体，则可以额外添加合适大小的气味瓶。陷阱区相对于试虫选择区有3 cm的落差，保证了试虫进入陷阱区后难以返回选择区，形成了无法逃逸的陷阱结构。因此，试验期间不需要进行实时的观察记录，只需要在试验结束后统计各陷阱区的试虫数，实现无人值守筛选。在试虫选择区与两个陷阱区之间的中央位置各有一个直径为7 mm的选择孔，两个通道之间距离为1.5 cm。当周围环境的光线不均匀时，正好位于中央位置的选择孔可以避免幼虫向光的一侧爬行误入陷阱区，也不会造成气味的混合，意味着幼虫必须在充分感受到气味后再做出行为选择，提高了试验结果的准确度。此外，根据不同的试虫种类或者大小，试验者可以设计不同直径大小的气流通道或者调节选择区的高度以满足试验的需要，更加灵活多变。目前，该装置已经获得专利授权（专利号：ZL 201720661832.7）。

2.2 小菜蛾幼虫对寄主、非寄主植物的选择行为反应

为了验证幼虫高效选择装置的可行性，我们比较了小菜蛾3龄幼虫对寄主植物以及非寄主植物挥发物的选择行为反应。行为选择试验表明（图2）：单独对大白菜、油菜和甘蓝的叶片进行选择性测试时，吸引指数分别为0.86（t = 26.540，P < 0.000 1）、0.80（t = 17.712，P < 0.000 1）和0.80（t = 26.911，P < 0.000 1），与空白对照相比具有极显著差异，反应率分别为98.33%、92.00%和85.33%。随后对这3种十字花科蔬菜进行两两组合比较后发现，选择行为存在显著或极显著的差异。小菜蛾幼虫在甘蓝与大白菜、油菜与大白菜这两个组合中，明显偏好选择大白菜（P < 0.000 1），吸引指数分别为0.62（t = 17.196，P < 0.000 1）、0.58（t =9.968，P < 0.000 1），反应率分别为93.00%和88.20%;在油菜与甘蓝的比较中，幼虫相对偏好选择油菜，吸引指数为0.23（t = 3.093，P = 0.015）。在驱避性试验中，小菜蛾幼虫对番茄叶片的挥发物表现出明显的驱避行为（t = 8.875，P = 0.012）。花生叶片对小菜蛾则不具有吸引和驱避的效果，表现为中性反应（t = 0.049，P = 0.963）。C7C46967-FEBA-473C-8AAF-0FC956033F0D

由以上结果可知，所设计的幼虫高效选择装置无论是在测试寄主植物对小菜蛾的引诱还是非寄主植物对小菜蛾的驱避作用方面均具有很强的特异性和可行性。

3 讨论

本研究设计并制作了用于测试鳞翅目幼虫嗅觉行为的高效选择装置，采用该装置测试了小菜蛾3龄幼虫对十字花科蔬菜挥发性气味以及非寄主植物番茄叶、花生叶挥发性气味的选择性，以检验其实际使用效果。测试结果显示，3种十字花科蔬菜均极显著地吸引小菜蛾3龄幼虫（P < 0.000 1），花生叶片对幼虫无吸引或驱避的效果（P > 0.05），番茄叶片对幼虫表现出60%以上的驱避率，说明该选择装置在测定幼虫对挥发物的行为反应上具有很强的特异性和可行性。蔬菜种类不同，引诱效果有明显差异。相较于油菜和甘蓝，小菜蛾明显偏好大白菜，与李洪山等[18]报道的小菜蛾对不同寄主取食偏好结果一致，均优先取食大白菜。在对油菜与甘蓝的偏好性上，本研究中发现小菜蛾优先取食油菜，而在李洪山等[18]的报道中，两者不存在显著性差异。小菜蛾对不同植物挥发性次生化合物的反应特异性极高，具有专一性，能识别不同蔬菜品种挥发性特征化合物的细小差别，完成寄主的选择定位[5]。因此可能是所选用的蔬菜品种不同导致的行为反应的差异，也可能是李洪山等[18]所采用叶碟法测定时，装置内的气流流通较差，幼虫无法区别气味的差异，而本装置则可以帮助幼虫精确地区分不同的气味来源。此外，由于该高效选择装置可以根据试验的需要一次性放入20～30头的幼虫数量，大大地提高了化合物筛选的效率。

嗅觉仪的基本原理是根据昆虫对不同气味源的偏好程度不同，在臂上连接不同的气味源后，昆虫会选择喜欢的气味一端，以此了解昆虫的嗅觉特点。Y形嗅觉仪，以及由此衍生出的嗅觉装置在研究昆虫成虫的行为反应和挥发物的鉴定中发挥了重要作用。但由于Y形嗅觉仪存在一些先天不足，限制了它的使用范围。迄今为止专门用于测定鳞翅目幼虫嗅觉行为的装置鲜有报道，根据嗅觉仪的基本原理，我们设计了用于研究幼虫行为的高效选择装置，经过反复测试，该装置不仅可以准确地测定幼虫的行为反应，而且可以一次性引入多头试虫，实现无人值守，极大地提高了研究效率和准确率。

对昆虫嗅觉的研究是探索利用行为调控绿色安全防治农业害虫的理论基础，目前已经开发利用了多种昆虫的化学信息物质，其中鳞翅目害虫的性诱剂和食诱剂以及鞘翅目的聚集信息素在害虫防治应用中取得了巨大的成功[16，19-20]。如今面对大量的化学信息物质的筛选，本研究期望能提供一種高效率筛选对鳞翅目幼虫具有引诱或者驱避作用的化学信息物质的嗅觉仪—高效选择装置，可以有效地帮助幼虫区分不同的气味源，引起相应的行为反应，为将来筛选用于防治鳞翅目害虫的化学信息物质提供一种新的装置。

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（责任编辑：田 喆）C7C46967-FEBA-473C-8AAF-0FC956033F0D