猪的衣原体感染

唐万勇　丁文格　蒋文明译，刘志滨　朱秀高校

（武汉回盛生物科技有限公司，湖北武汉430042）



猪的衣原体感染

唐万勇丁文格蒋文明译，刘志滨朱秀高校

（武汉回盛生物科技有限公司，湖北武汉430042）

摘要：衣原体）是一类专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，可引起人和动物的多种疾病。在猪上已经分离到的衣原体包括猪衣原体）、羊流产衣原体、兽类衣原体和鹦鹉热衣原体。衣原体感染猪，可引起多种不同的病症，包括结膜炎、肺炎、心包炎、多发性关节炎、多发性浆膜炎、伪膜性或坏死性小肠炎；对母猪可致产后无乳征（PPDS）、阴道分泌物增加、返情、流产、木乃伊胎、弱仔、围产期和新生仔猪死亡增加；对公猪则引起精液品质下降、睾丸炎、附睾炎和尿道炎。不过衣原体病被看作是不太重要的猪病，因为关于猪衣原体病的报道微乎其微；此外，在兽医实验室的常规诊断中并不包括衣原体检测，因而衣原体常常不会引起重视；另外一方面，衣原体常常和其他病原混在一起，而这些病原更加容易被检查到。但是，近期的研究证实，衣原体对种公母猪和仔猪的感染比预想的要更为普遍，对经济效益的影响也很重要。本文对猪衣原体病作一概述，内容包括：猪衣原体病的分类学、诊断注意事项、流行病学和病理学、公共卫生意义和如何防治本病。

关键词：猪衣原体；分类；诊断；流行病学；防治

1　简介

图1　衣原体的生活史和形态（唐万勇制图，2012）

不过也有一些研究描述了衣原体发育中的另外一些形态，如不规则的、体积更大的网状体样结构，称为异体（aberrant bodies，ABs）。这些结构常见于衣原体的持续感染过程中。

最早认识到衣原体感染猪是在1955年。在美国，Willingan和Beamer从发生关节炎和心包炎的仔猪上首次分离到衣原体。在20世纪六七十年代，东欧和俄国的集约化猪场持续发生的支气管肺炎和流产，被认为和衣原体感染有关。1969年，在西欧首先分离出猪衣原体的一些菌株，这些菌株分离自奥地利的众多患有多发性关节炎、多发性浆膜炎、肺炎、结膜炎和肠炎的仔猪体内，或分离自流产母猪，以及温和性的消化道感染的仔猪。20世纪80年代，在德国的临床健康猪和病猪体内又分离出了一些衣原体菌株。20世纪90年代，在美国内布拉斯加州和爱荷华州的不同阶段的猪群中，从患有结膜炎或角膜结膜炎的病猪的结膜样品中，不断分离到猪的衣原体。不同猪场的很多有结膜炎的保育猪同时表现腹泻，后续剖检多数也伴有肺炎的表现，从肠道和肺均分离到衣原体。20世纪90年代，在德国和瑞士，从返情、流产、患肠道疾病和亚临床消化道疾病的猪群也常常可以分离到衣原体。

如文献报道，用衣原体的田间菌株感染悉生猪（无菌猪），可以复制衣原体病的感染。猪衣原体病包括结膜炎、肺炎、伪膜性或坏死性肠炎。而且，猪衣原体和一系列的疾病有关，包括仔猪的心包炎、多发性关节炎、多发生浆膜炎，以及各种繁殖障碍如阴道分泌物增多、返情、流产、木乃伊胎、弱仔、围产期和新生仔猪死亡率高和公猪的睾丸炎、附睾炎、尿道炎。但在上述所有的症候当中，仍然需要进一步确证衣原体的致病作用。Eggeman等观察到了母猪产后无乳征（PDS）的发病率和衣原体血清阳性率之间的相关性，不过还没有证据证明，猪衣原体就是无乳征的病原。

衣原体病仍被看作是一种不太重要的猪病，因为在绝大多数的兽医诊断实验室，衣原体并非常规检测项目，而且衣原体常常和其他病原混在一起。

现在，衣原体在种公母猪和仔猪的感染比原先预想的要更加普遍。羊流产衣原体、兽类衣原体、鹦鹉热衣原体和猪衣原体均能够感染仔猪。

2　猪的衣原体的分类学

1999年，Everett等基于16s rRNA和23s rRNA序列分析，建议将衣原体重新划分成两个属，即衣原体属和嗜衣原体属，其分类结果见表1。但是，通过对不同种类的衣原体作基因组并进行比较（表2），得出的结论和以前一致，即：不同宿主的衣原体，其生物学和生态学特性仍然高度相关。所以，基于核糖体序列分析把衣原体分成多个属的做法，既不符合基因组比较所揭示的衣原体的自然规律，也未被研究者们广泛接受。因而，在Everett等的提议8年以后，人们又把衣原体合并为同一个属，即衣原体属。以下就衣原体的具体分类作一介绍。

羊流产衣原体先前划归反刍兽衣原体血清1型。该种衣原体有一个明确的血清型，而且其核糖体和外膜蛋白A的序列几乎100%保守，但是所有菌株的染色体上存在一个特别的未被鉴定的质粒。反刍兽B577菌株(ATCC VR 656)是该型的参考菌株。

羊流产衣原体是导致羊、牛和山羊流产的主要原因之一，在全球范围发生，且已证实与马、兔、豚鼠、老鼠和猪的流产有关。此外，怀孕的妇女如果和感染动物接触，是有风险的，因为此病是一种人兽共患病，也可导致人的流产。猪感染羊流产衣原体，主要是引起流产和弱仔。迄今，尚没有猪将此病传给人的报道。

兽类衣原体只能从哺乳动物分离到。不同的菌株，其血清型和致病性非常不一致。其两个菌株E58株和Koala II株，都有一个特别的染色体质粒pCp。其参考菌株是E58株(ATCC VR 628)。

在反刍动物、猪和有袋类动物考拉体内都可分离到兽类衣原体。兽类衣原体和很多疾病有关，可引起考拉的结膜炎、繁殖障碍、不育和尿道疾病。此外，可引起绵羊、山羊、牛、马和猪的一大类疾病，包括尿生殖道感染、亚临床的消化道疾病、流产、结膜炎、乳房炎、脑脊髓炎、肠炎、肺炎、多发性关节炎、胸膜炎和心包炎等。

鹦鹉热衣原体主要感染鸟类，不过也零星感染人。其在鸟类之间的传播途径主要是吸入被污染的眼和鼻分泌物的气溶胶，或沾染了羽毛和粪便的灰尘；也可经由蛋垂直传播。已知鹦鹉热衣原体有9个基因型（A-F，E/B，M56和WC），各型都可传给人。某些型有一个特别的染色体质粒。其代表菌株是6BC株（ATCC VR 125）。

表1　衣原体分类学

3　诊断

诊断实验室对猪病的常规检查不包括衣原体。分离衣原体最便捷的方法是细胞培养。但是在分离猪的衣原体菌株时，细胞培养只有部分可以成功，因为在已有的细胞系上，衣原体生长十分困难，培养技术需要做相应改进。Guseva等使用猪生殖道上皮细胞离体培养，用于研究沙眼衣原体感染和致病机制，主要检查其对繁殖激素调节方面的作用，在此致病模型的研究使用的是猪衣原体S45菌株。结果表明，猪的原代细胞可用于衣原体诊断，该细胞可在含10%二甲基亚砜的DMEM-F-12培养基中，-80℃冻存数周，且解冻后可在3～5天生长为单层细胞。但传代细胞系更为方便和便宜。Schiller等在不同条件下培养了猪的几种衣原体。对细胞培养物离心，同时用放线菌酮处理，二者结合可以最好地检出包涵体。有趣的是，用伊思考夫改良杜尔贝可培养基（Iscove’s modified Dulbecco’s medium）代替EMEM培养基（Eagle’s minimal essential medium）培养Vero细胞，显著增加了猪衣原体包涵体的检出率。但是，使用CaCo细胞比Vero细胞更易检出猪衣原体和兽类衣原体的包涵体。

ELISA方法因其便利性，普遍用于检测衣原体抗原。用于检测人沙眼衣原体的试剂盒现在大量用于兽医检测，因其设计时，检测的是衣原体科的特异性脂多糖抗原，因而能够检测所有种类的衣原体。

表2　衣原体基因组测序结果

组织切片的免疫组化染色常在兽医上用于诊断衣原体，因兽医诊断实验室常有自动染色的设备。在以链霉亲和素-生物素方法（streptavidin-biotin method）作免疫组化染色时（Dako ChemMateTM检测试剂盒；Dako公司，比利时海弗莱），可使用衣原体科特异性的鼠单抗直接检测衣原体的脂多糖（LPS抗原；Clone ACI-P，Progen公司，德国海德尔堡）或使用衣原体属特异性的鼠单抗检测沙眼衣原体的重组HSP60抗原（clone A57-B9，Milan Analytica AG，瑞士罗氏）。不过异常小体（ABs）常不能很好染色，尤其是使用抗HSP60的单抗时。

PCR技术已经用于诊断动物衣原体，可代替病原分离方法。若方法设计得当，则其特异性突出，敏感性与操作良好的病原分离方法相当甚至更好。从生物安全的角度考虑，样品可在检测之前进行灭活处理。目前的PCR检测主要针对衣原体的基因、16S-23S rRNA或者基因。针对16S-23S rRNA的PCR方法敏感性更高，因在衣原体中常出现这些基因拷贝。但是和其他细菌的交叉反应会影响结果。PCR的敏感性和特异性也受到样品制备的影响。如果所准备的样品要推迟做PCR检测，则要使用试剂保持样品DNA的稳定。DNA样品的准备可使用便宜的试剂或商品化的试剂盒处理。针对相对较短的DNA片段做PCR，使用套式PCR或实时PCR均可提高PCR的敏感性。套式PCR非常敏感，但是操作时千万要注意污染问题。实时PCR需要标记探针和特殊设备，因而检测成本高一些，其敏感性和套式PCR差不多，但污染较小、检测操作简化，因其一个封闭的系统内只有一个反应，且常以尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）消除污染。

几年前，Sachse等用ArrayTubeTM平台，设计了用基因芯片技术检测衣原体的方法(Clondiag Chip Technologies，德国耶拿)。此方法适合于对衣原体的细胞培养物做明确的鉴定，对临床组织样品也可直接定性。可惜现在还不能将此项技术用于猪的常规检测，因为一份样品的检测费用需要24欧元，实在是太贵了。

PCR测序可以比较不同衣原体分离株的序列差异，这些信息可以用于系统发育分析，从而有助于分类和流行病学分析。对猪的衣原体分离株，针对基因作序列分析作用不大，作者认为，鹦鹉热衣原体和羊流产衣原体的基因的序列同源性很高。多位点序列分型（multi locus sequence typing，MLST）也已经用于猪的衣原体的分型，包括羊流产衣原体、兽类衣原体和鹦鹉热衣原体。

4　猪衣原体感染的流行病学

4.1血清学

最早的关于猪衣原体的血清学数据是欧洲在1966年做的，当时Wilson和Plummer对英国的仔猪血样用毛细管凝集试验测衣原体抗体，结果23%为阳性。

目前，衣原体在比利时的猪群中呈地方性流行，用一种衣原体科特异性的重组ELISA方法检测249个猪群，结果有240个猪群呈血清学阳性，阳性率96.4%。该ELISA试剂板包被的是重组的主要外膜蛋白（MOMP），源自一株禽D型鹦鹉热衣原体。重组的MOMP由是由COS-7 cells而非大肠杆菌表达，这是为了模拟真核细胞的糖基化，以避免大肠杆菌的脂多糖片段。在原核表达系统中，纯的重组蛋白不可避免地混杂有脂多糖。

德国的衣原体血清学阳性率在母猪和公猪上分别达到33%～72%和10%～47%。在瑞士，母猪群的阳性率是62%，4周龄的仔猪阳性率是6.9%，而超过4周龄的仔猪群阳性率达到了48.1%。这些检测采用了基于脂多糖（LPS）的ELISA方法，Wittenbrink等对此做了描述。意大利的肥猪群阳性率在63.5%～80.3%之间，检测方法是以纯化的原生小体为抗原，作微量免疫荧光（micro-immunofluorescence test，MIF）检测。Bagdonas等用补体结合试验（complement fixation test，CFT）检测立陶宛的猪群，血清学阳性率为7.7%。但是，若采用衣原体的脂多糖（LPS）或原生小体（EB）作为抗原来检测血清抗体，因确实可与其他病原出现交叉反应，故血清学结果的判读应保守一些。并且，补体结合试验的敏感性和特异性都不如ELISA。

邱昌庆、周和邱报道了中国猪群的衣原体血清学情况，仔猪阳性率是11%，母猪群则为80%。最近对华南地区广东省所做的调查表明，种公猪、种母猪和育肥仔猪的血清学阳性率分别是63.38%、41.10%和36.25%，检测所用的试剂盒是一种商品化的间接血凝试剂盒（IHA试剂盒，中国农业科学院兰州兽医研究所）。我们目前还没有其他国家的猪衣原体方面的血清学数据。

4.2分子生物学诊断

血清学用于检测猪群的衣原体感染状态，针对衣原体科的特异性抗原。但是，所有目前的血清学方法无法确定是哪一种衣原体感染，因而，最新的分子生物学研究可提供更为详细的信息，来确定不同种类衣原体的流行情况。

近来已经开发出了一些衣原体种特异性的核酸扩增方法（nucleic acid amplification tests，NAATs），如实时PCR和基因芯片技术，用于检测核糖体基因间隔和23rRNA的I区基因；Dugan等则研究了一种PCR方法用来检测衣原体的四环素耐药（TcR）基因tet(C)。这些方法都在近期用于猪的不同衣原体感染的检测。

分子生物学诊断结果显示，鹦鹉热衣原体DNA只是零星见于猪。兽类衣原体在猪群的感染也非常少，使用基因测序方法检测，公猪精液、胎儿和肠道组织的兽类衣原体的基因阳性率分别是2%、5%和9%。从一头偶然死于采血的比利时猪的肺脏鉴定出羊流产衣原体。尽管羊流产衣原体主要是和繁殖失败有关，但先前也是从猪的肺部分离到。

在比利时、德国和瑞士的猪群中，引起肠道感染的衣原体病原绝大多数是猪衣原体，而羊流产衣原体则在这些研究中几乎未被发现。德国、瑞士和爱沙尼亚的规模化猪场，猪衣原体主要和结膜炎有关。而且，在一次德国的研究中，在猪的肺和肠道，还发现了猪衣原体和羊流产衣原体的混合感染。

在德国图林根州的野猪群，经由套式PCR方法检测，发现衣原体阳性率达到57.1%，主要检出部位是肺部。作基因片段扩增和测序，发现野猪内存在鹦鹉热衣原体、羊流产衣原体和猪衣原体。这些研究结果显示，野猪可能是衣原体在野生动物的储藏库。

5　致病性

5.1实验感染

Pavlov等最先用在比利时分离的衣原体菌株感染小仔猪，这是最早的实验研究。猪感染后表现角膜结膜炎、发热、厌食和精神沉郁。

文献报道了4株可引起结膜炎的猪衣原体：H5、H7、R22（美国）和DC6（德国）；14株由意大利分离的可致结膜炎和/或繁殖障碍的猪衣原体：MS1至MS14；5株消化道致病菌株：R19、R27、130、132（美国）和S45（奥地利）；2株呼吸道致病菌株：R24 和R33（美国），详见表3。所有的猪衣原体菌株除了S45株以外，皆由临床发病猪分离而得。在悉生猪上，已经用多个菌株复制出疾病，完成了对衣原体的科赫法则验证，包括H7株复制出结膜炎，用R19株和R27株复制出消化道损伤，用R33株复制出肺和鼻损伤。S45株是从亚临床感染的仔猪粪便中分离而来，但仍有致病性，因用其感染悉生猪可致明显的肠道疾病。Pospischil等报道了在悉生猪的实验性感染中，见到了猪衣原体的非正常发育形式（即见到一种比EB更大的结构，所谓“异体”，简称AB-译者注），表明存在持续感染，这是很有意思的现象。

表3　猪上分离到的猪衣原体

对普通的吃母乳的仔猪，使用猪衣原体以气溶胶途径攻毒，证实其对猪呼吸系统具有致病性。在随后的研究中，6周龄仔猪用109包涵体形成单位（inclusion forming units）的衣原体接种，所有仔猪表现出急性感染症状，表现为干咳、流清涕、严重的呼吸困难，并伴有喘息、呼吸急促甚至呼吸骤停。体温40℃以上至少5天。临床症状可持续7天。

猪衣原体和羊流产衣原体是否导致猪的繁殖障碍仍有争议，原因之一在于在通过致病模型来验证科赫法则时常面临伦理方面的问题，这需要对衣原体阴性母猪人工接种这两种衣原体，且要对不同妊娠阶段的母猪都做。此外找到衣原体阴性母猪极其困难。我们发现只有一次使用羊流产衣原体的感染试验，这项研究选用了4头妊娠42日龄的母猪，接种鹦鹉热衣原体血清1型中的一个反刍动物菌株，结果出现胎膜感染，但未导致流产。

Guscetti等研究了从鸽子上分离的鹦鹉热衣原体（T49/90菌株）对3日龄悉生猪的致病性，试验采用胃内接种途径，结果猪只出现肠道感染症状，肠道呈温和的损伤，猪只有一点全身性症状，经由粪便排菌。这说明猪可能是禽类衣原体的宿主。而对3日龄的仔猪口服接种猪衣原体，则表现出比鹦鹉热衣原体（鸽源T49/90菌株）或羊流产衣原体（S26/E菌株）的毒力更强。

5.2自然感染

由于衣原体种特异的诊断尚不能开展，因而对不同种的衣原体在猪上的流行率、人畜共患风险和经济影响难以确定。最近已经开发了几种衣原体种特异性的核酸扩增技术（NAAT），并已用于研究不同的衣原体种在猪的流行率和经济影响。研究表明，猪群普遍存在衣原体感染，其中以猪衣原体为甚。和其他衣原体相比较，猪衣原体更具遗传多样性，这一点可从猪的衣原体致病性和毒力不一致的各种报道得以印证。猪衣原体导致的肠炎在商品猪群似甚为常见，其症状多为亚临床型。不过，对这个病原体的伊文思法则已经得到了检验（即通过人工致病模型检验了衣原体的致病性。Evans postulates，伊文思法则，是检验病原致病性的一种推论，类似科赫法则-译者注），而且该病原体的致病性可能比预想的高。猪衣原体还和母猪返情有关（妊娠母猪的早期胚胎死亡率超过50%），也导致公猪精液品质下降（活力降低，死精比例超过50%），在比利时、塞浦路斯、爱沙尼亚、德国、以色列和瑞士的猪场皆证实这些繁殖失败的问题。Becker等发现德国和瑞士的眼睛有问题的猪群中，从眼部查到猪衣原体的阳性率非常高，分别达到90%和79%。一般来讲，规模化饲养的猪，衣原体很容易感染眼睛，导致结膜炎。Schautteet等也在爱沙尼亚一家大猪场见到了衣原体导致的结膜炎和繁殖失败的病例。猪衣原体、兽类衣原体、羊流产衣原体可从流产的胎儿内分离到。Eggemann等发现衣原体PCR阳性率和繁殖障碍发生比例之间呈显著相关性，这些繁殖障碍包括流产、出现死胎和低活力仔猪的窝数。血清学阳性猪场的窝均断奶仔猪数显著减少。Hoelzle等设计两种PCR方法，分别检测基因（编码MOMP，40 kDa）或基因（编码富含半胱氨酸的膜蛋白，60 kDa）。这种PCR方法并非种特异性，但可从肺、消化道和猪的子宫颈拭子等检测猪衣原体、兽类衣原体和羊流产衣原体。结果在有呼吸道问题和繁殖障碍的样本中，分别有49%和60%的阳性率；从24.5%的健康对照的呼吸道样本中检到衣原体DNA，而从健康的宫颈对照样本中则未检到衣原体。此外，他们用限制性片段长度多态性（restricted fragment length polymorphisms，RFLP）分析和DNA基因测序分析，发现在肺和肠道的混合感染比例非常高。

6　公共卫生意义

已有文献记述了羊流产衣原体和鹦鹉热衣原体可致人畜共患。但我们尚未看到猪传人的报道。猪衣原体以前曾被当作沙眼衣原体，可能也能是一种人畜共患病原，但也没有人畜传播的报道。

7　防治

衣原体科的微生物对能够影响其脂质含量或破坏细胞壁完整性的物质非常敏感。病猪舍和器具的清洁非常重要，因为衣原体可在粪便和垫料中存活长达30天。大多数常用的清洗剂和消毒剂都能使衣原体灭活，包括：1∶1000倍稀释的季铵盐，70%异丙醇，1%来苏尔，1∶100倍稀释的家用漂白粉或氯酚。对衣原体的通常的传染源、传播途径、可能的传播媒介和传染动力学的检查尚不充分。

现如今对衣原体感染的治疗主要是抗生素。一般来说，四环素类药物（金霉素、土霉素、强力霉素）对衣原体感染是有效的。对四环素耐药的猪衣原体，可以使用氟喹诺酮（恩诺沙星）或大环内酯药物（红霉素）。特别是恩诺沙星可看作是对四环素耐药衣原体的解决方案。

迄今还没有猪用衣原体疫苗。用于其他动物的衣原体疫苗如果用于猪，可能没什么效果，因为无论基因型还是血清型彼此都非常不同。Knitz等从猪场母猪的阴道分泌物分离到一株羊流产衣原体（OCHL03/99），用福尔马林灭活制成疫苗，免疫同场母猪，这可看作是衣原体疫苗研究的开端。和对照组比较，免疫组的血清IgG抗体水平无论是初免还是二免都显著升高，但未检查临床保护情况。最近，Zhang等报道了用羊流产衣原体免疫小鼠的有关数据，试验使用一种DNA疫苗加重组MOMP联合免疫，显示了免疫保护。不过，我们还要进一步理解衣原体的免疫保护机制和可能的免疫损伤机制，以开发出更具潜力的衣原体疫苗。

译自：Schautteet K,Vanrompay D.Chlamydiaceae infections in pig[J].Veterinary Research,2011，42：29.

收稿日期：2015-11-26

中图分类号：S858.28

文献标识码：A

文章编号：1673-4645(2016)03-0045-07