四连接素基因敲除小鼠表现出脊柱后凸畸形和骨质疏松症的特征

茹德文　颜玉峰　李　炳　谢　强　汤　日　沈　晓　余　果　杜嘉瑞　王尔松△

(1复旦大学附属金山医院神经外科,2中心实验室　上海　201508)



四连接素基因敲除小鼠表现出脊柱后凸畸形和骨质疏松症的特征

茹德文1颜玉峰1李炳2谢强1汤日1沈晓1余果1杜嘉瑞1王尔松1△

(1复旦大学附属金山医院神经外科,2中心实验室上海201508)

【摘要】目的研究四连接素 (tetranectin,TN)基因敲除对小鼠骨骼生长发育的影响,从而探究该基因的正常生理功能及其缺失与疾病的关系。 方法通过基因同源重组的方法构建出TN基因敲除 (TN(-/-))小鼠模型,分别对2月龄和8月龄的TN(-/-)雄性小鼠 (n=10)和同龄野生型(wild-type,WT)雄性小鼠 (n=10)进行全身正侧位X线摄片和脊柱后凸角度 (Cobb角)测量,并对8月龄TN(-/-)雄性小鼠 (n=10)和WT雄性小鼠 (n=10)的多部位骨骼进行骨密度 (bone mineral density,BMD)及骨矿含量 (bone mineral content,BMC)测定和病理切片检查,所得数据进行统计学分析。结果TN(-/-)小鼠与同龄WT小鼠体质量无明显差异;2月龄及8月龄TN(-/-)小鼠Cobb角均较同龄WT小鼠显著增大 (P<0.01),且随月龄增加,Cobb角显著增大 (P<0.01);8月龄TN(-/-)小鼠的胸椎椎间盘结构不对称,外侧纤维环呈增大、疏松改变;与同龄WT小鼠相比,8月龄TN(-/-)小鼠全身、腰3椎体和左侧股骨BMD及BMC显著降低 (P<0.05),股骨及腰椎在组织学上也呈现出骨小梁变细、稀疏、排列紊乱或断裂等特点,且骨小梁成骨细胞减少,破骨细胞增多。结论TN(-/-)小鼠表现出脊柱后凸畸形和骨质疏松症的特征，提示TN与骨骼的正常生长发育关系密切。TN(-/-)小鼠作为一种潜在的脊柱后凸畸形或骨质疏松症疾病动物模型具有重大的研究意义。

【关键词】四连接素;基因敲除;脊柱后凸畸形;骨质疏松症;小鼠

*This work was supported Science and Technology Commission of Shanghai Municipality,China (124119a1900) and Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (20124339).

四连接素 (tetranectin,TN)属于C型凝集素家族成员。自1986年从人类血浆中被分离纯化出来之后[1],即被发现与多种疾病密切相关[2-6]。然而,其生物学功能和作用机制目前尚不清楚。研究表明,TN可能在组织重塑以及骨骼成骨过程中的矿化阶段起到重要作用[7],而且与骨折的早期愈合密切相关[8]。为了进一步探究TN与骨骼生长发育之间的潜在关系,我们与上海南方模式生物研究中心合作研发了TN基因敲除的小鼠模型。本研究通过对TN基因敲除 (TN-/-)小鼠和其同龄野生型 (wild-type,WT)小鼠的骨骼系统进行形态学、计量学及组织病理学的对比分析,探索TN与骨骼生长发育的潜在关系,为进一步研究TN的生理功能及作用机制奠定基础,也为TN-/-小鼠的进一步应用提供理论依据。

材 料 和 方 法

TN-/-小鼠与WT小鼠利用基因重组进行基因敲除的方法构建出C57BL/6 TN-/-小鼠,微生物学等级为SPF级。造模建系后进行PCR及Western blot检测。WT小鼠为同龄野生型小鼠。

分组随机取2月龄TN-/-雄性小鼠和同龄WT雄性小鼠各10只,进行全身X线摄片;随机取8月龄TN-/-小鼠和同龄WT小鼠各10只,进行全身X线摄片、骨密度 (bone mineral density,BMD)测定和病理学检查。

小鼠全身X线摄片小鼠经腹腔麻醉后,固定于胶片上,采用德国西门子MULTIX-TOP X线光机进行全身正侧位X线摄片,曝光参数为30 mA和38kV。

脊柱后凸角度 (Cobb角)测量X线摄片完成后,采用测量Cobb角 (胸7椎体至腰4椎体)的方法[9]分别测量各组小鼠脊柱后凸角度。

BMD及骨矿含量(bone mineral content,BMC)测定8月龄小鼠经腹腔麻醉后,用Hologic QDR-4000DXA双能X线骨密度仪进行BMD及BMC测定,测定部位包括全身、腰3椎体和左侧股骨。

病理学检查8月龄小鼠经腹腔麻醉后,采用经心脏生理盐水及4%多聚甲醛灌注固定组织。取小鼠的胸椎、腰椎及股骨组织,经常规10% EDTA脱钙、石蜡包埋、组织切片、HE染色后,使用OLYMPUS BX43普通光镜行病理学检查。

结果

PCR及Westernblot检测剪取小鼠尾尖抽提DNA及蛋白质,分别从基因及蛋白表达水平进行检测,鉴定出TN-/-小鼠(图1)。

A:PCR detection of DNA extracted from the tip of the mouse’s tail.The DNA bands of WT mice were 575 bp and TN-/-mice were 711 bp.While the DNA binds of heterozygous mice were both 575 bp and 711bp. B:Western blot detection of protein extracted from the tip of the mouse’s tail.WT mice were tetranectin positive,while TN-/-mice were tetranectin negtive.

图1鼠尾PCR及Western blot检测结果

Fig 1PCR and Western blot detection of

TN in filial generation mice

各组小鼠体质量各组小鼠体质量比较结果 (图2):2月龄TN-/-小鼠和WT小鼠的体质量分别为(19.50±3.75) g和(18.50±3.78) g,两组间体质量差异无统计学意义 (P> 0.05);8月龄TN-/-小鼠和WT小鼠的体质量分别为(30.80±5.27) g和(29.50±4.74) g,两组间体质量差异无统计学意义 (P>0.05)。

No statistical difference between TN-/-mice and their WT littermates (P>0.05).

图2各组小鼠体质量情况

Fig 2Body weight of each group

X线摄片WT小鼠未发现脊柱后凸畸形,而2月龄TN-/-小鼠中有5只出现明显脊柱后凸畸形,8月龄TN-/-小鼠中有8只表现出明显脊柱后凸畸形,且随月龄增加,脊柱后凸程度有加重趋势;8月龄TN-/-小鼠X线片还显示出BMD减低、骨小梁稀疏或塌陷、骨皮质变薄的特点 (图3)。

Compared with their WT littermates,TN-/-mice exhibited features of kyphosis and the severity of kyphosis aggravated apparently with age in TN-/-mice.Moreover,eight-month-old TN-/-mice developed features of reduced BMD,sparse bony trabeculae and thinner cortical bone in multisite.

图3TN-/-小鼠和WT小鼠脊柱后凸比较

Fig 3Radiographs of WT mice and TN-/-mice

脊柱后凸角度2月龄TN-/-小鼠脊柱后凸角度 (Cobb角)明显大于同龄WT小鼠,差异有统计学意义 (P<0.01);8月龄TN-/-小鼠Cobb角也明显大于同龄WT小鼠,差异有统计学意义 (P<0.01);且8月龄TN-/-小鼠较2月龄TN-/-小鼠Cobb角显著性增大 (P<0.01),说明随月龄增加,TN-/-小鼠脊柱后凸程度明显加重 (表 1)。

表1　TN-/-小鼠和WT小鼠Cobb角比较

(1)vs. WT mice,P<0.01;(2)vs. 2-month-old TN-/-mice,P<0.01.

BMD及BMC分别对8月龄的WT小鼠和TN-/-小鼠进行BMD及BMC测定后发现,TN-/-小鼠全身、第3腰椎和左侧股骨BMD及BMC均明显低于同龄WT小鼠,差异有统计学意义 (表 2)。这说明,8月龄的TN-/-小鼠较WT小鼠骨量已明显丢失,出现了骨质疏松的特点。

表 2　8月龄WT小鼠与TN-/-小鼠全身、腰3椎体及左侧股骨的BMD 和 BMC比较

vs. WT mice,(1)P<0.05;(2)P<0.01.

病理学检查结果与同龄WT小鼠相比,8月龄TN-/-小鼠的胸椎椎间盘结构明显不对称,外侧纤维环呈增大、疏松改变,生长板并未观察到异常改变 (图4);8月龄TN-/-小鼠股骨及腰椎在组织学上也呈现出骨小梁变细、稀疏、排列紊乱或断裂等特点,且骨小梁成骨细胞减少,破骨细胞增多 (图5)。

Asymmetric thoracic intervertebral disc structure and expanded and loose fibrous ring of intervertebral disc were distinct in TN-/-mice.However,abnormal changes of growth plate were not observed (HE,×100).

图48月龄WT小鼠与TN-/-小鼠胸椎椎间盘

病理学变化比较

Fig 4Pathological section observation of thoracic

intervertebral disc in 8-month-old TN-/-mice

and their WT littermates

讨论

TN广泛分布于多种细胞、细胞外基质及组织中。目前认为,TN在骨骼和肌肉细胞的分化及成熟、骨生成及矿化、组织重塑和骨折愈合等生理过程中起重要作用[7-8,10]。并且,TN在这些生理过程中作用的发挥可能都与纤溶酶原激活系统 (plasminogen activitor system,PAS)中的纤溶酶原 (plasminogen,Plg)有关。TN可能在低钙环境下与Plg的kringle 4区结合并使之激活而裂解成纤溶酶,从而在蛋白溶解过程中起调节作用[11]。蛋白溶解活性在骨骼形成过程中极其重要,有研究报道,基 质金属蛋白酶(matrix metallo-protein,MMP)系统中的基质金属蛋白酶-9/明胶酶B (MMP-9/gelatinase B)和膜型基质金属蛋白酶1 (MT1-MMP)基因缺失小鼠在骨骼生长板血管化和骨化的过程中均出现异常[12-13],最终造成骨骼发育缺陷。而MMPs酶原的最重要的激活剂就是PAS中的纤溶酶。这说明,TN可能通过蛋白溶解系统在骨生成和骨骼发育的整个过程中发挥重要的生理功能。2001年Iba等[14]建立了TN-/-小鼠模型,并且发现部分6月龄以上TN-/-小鼠出现了明显脊柱后凸畸形,而对6月龄以下TN-/-小鼠的情况未进行描述。另外,作者还对4～6月龄的TN-/-小鼠的全身BMD进行了测量,未发现与WT小鼠全身BMD有差异。但是,研究中没有对全身多部位BMD及BMC进行测定,也未对6月龄以上TN-/-小鼠的BMD及BMC进行评估。我们于2012年成功构建了TN-/-小鼠模型,并对不同月龄小鼠骨骼生长发育情况进行了研究。

研究结果显示:与同龄WT小鼠相比,2月龄TN-/-小鼠的Cobb角与同龄WT小鼠相比显著增大,已经出现了明显的脊柱后凸畸形,且8月龄TN-/-小鼠的Cobb角较2月龄TN-/-小鼠显著性增大,说明随月龄增加,TN-/-小鼠的脊柱后凸程度也明显加重;同时,病理学检查显示:8月龄TN-/-小鼠的胸椎椎间盘结构明显不对称,外侧纤维环呈增大、疏松改变,而生长板并未观察到异常改变,这表明TN-/-小鼠的脊柱后凸很可能是由于胸椎椎间盘病变所致。我们对8月龄TN-/-小鼠及同龄WT小鼠进行BMD及BMC测定后发现,8月龄TN-/-小鼠全身及第3腰椎、左侧股骨等部位的BMD及BMC均明显低于同龄WT小鼠,差异有统计学意义。这说明8月龄TN-/-小鼠出现了明显骨量丢失,表现出骨质疏松。X线摄片及组织病理学结果也与BMD及BMC的测定结果相符合,8月龄TN-/-小鼠多处骨骼呈现出BMD减低、骨小梁变细、稀疏、排列紊乱或断裂等特点,且骨小梁成骨细胞减少,破骨细胞增多。

Compaired with WT mice,TN-/-mice exhibited characteristics of thinner,sparse and rupture of femur bone trabeculas (A and B,×100). Decreased osteoblasts (shown in yellow triangle) and increased osteoclasts (shown in red triangle) were observed in the femur bone trabecula of TN-/-mice (C and D,×400). The features of thinner,sparse,disordered arrangement or rupture of bone trabeculas were also observed in the lumbar vertebras of TN-/-mice (E and F,×200)

图58月龄WT小鼠与TN-/-小鼠股骨、腰椎病理学变化比较 (HE染色)

Fig 5Pathological section observation of femurs and lumbar vertebras in 8-month-old TN-/-mice and their WT littermates (HE staining)

脊柱后凸畸形严重影响患者的健康生活,可致背部疼痛,甚至发生严重的神经功能损害或截瘫,患者较为痛苦且致残率高。而青年性脊柱后凸畸形,又称休门病 (Scheuermann’s disease),在普通人群中的发病率可高达8.0%[15]。然而,其病因目前尚不清楚。有研究认为,休门病的发生可能与胶原代谢异常有关[16-17]。我们的研究中发现,TN-/-小鼠在2月龄时即出现了明显脊柱后凸畸形,与休门病的表现类似。而TN通过激活蛋白溶解系统与胶原代谢也密切相关。休门病的发生过程中是否也发生了TN基因的突变或缺失？如果是这样,那么TN-/-小鼠是否可以作为研究休门病的合适的疾病动物模型？因此,对TN的进一步研究有可能对休门病的病理病因研究和早期诊治起到重大作用。

骨质疏松症是临床常见的慢性进行性疾病,严重威胁着老龄化人口的健康,其发生原因主要是骨量的过量丢失。Wewer等[7]研究发现在骨骼成骨过程中,TN有促进骨质矿化的作用。本研究中发现,8月龄TN-/-小鼠BMD及BMC明显降低,骨矿明显丢失,出现骨质疏松的特点,X线片也显示出骨质疏松的表现,且骨组织病理学上也呈现出骨质疏松的典型特点,这与Wewer等[7]的研究结果相一致。而Iba等[14]的研究数据显示4～6月龄的TN-/-小鼠的全身BMD未明显降低,原因可能是:(1) 全身BMD仅代表全身BMD的平均水平,不能确切反映出易发生骨质疏松部位的骨质变化情况;(2) 骨质疏松的发生和年龄关系紧密,4～6月龄TN-/-小鼠骨质疏松的程度可能尚不明显。我们对8月龄TN-/-小鼠的研究中不仅测量了全身BMD,而且对腰椎、股骨等骨质疏松易累及部位的BMD也进行了测量,同时还测定了BMC,从两个角度来评估8月龄TN-/-小鼠的骨质疏松情况。并且,股骨和腰椎骨组织病理学结果也与BMD及BMC的测定结果相符合。结果显示8月龄TN-/-小鼠表现出典型骨质疏松症的特征,这为骨质疏松症的研究提供了新的思路。

总而言之,我们的研究结果进一步证实TN与骨骼生长发育相关的生理过程有着密切联系,为进一步研究休门病等脊柱后凸畸形及骨质疏松症提供了新的思路。TN-/-小鼠作为一种潜在的脊柱后凸畸形或骨质疏松症疾病动物模型具有重要的研究意义。

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Tetranectin knock-out mice exhibit features of kyphosis and osteoporosis

RU De-wen1,YAN Yu-feng1,LI Bing2,XIE Qiang1,TANG Ri1,SHEN Xiao1,YU Guo1,DU Jia-rui1,WANG Er-song1△

(1DepartmentofNeurosurgery,2CentralLaboratory,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201508,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of tetranectin (TN) deletion on mice skeleton growth and development,and to explore the physiological function of TN gene and the relationship between its deletion and diseases.MethodsTN gene knock-out (TN(-/-)) mice were generated by the method of gene homologous recombination.In two-month-old and eight-month-old TN(-/-) mice,X-ray radiography of whole body anteroposterior and lateral position were carried out,and the angle of kyphosis (namely Cobb’s angle) was detected,respectively,as well as their wild-type (WT) littermates. Moreover,bone mineral density (BMD),bone mineral content (BMC),and pathological sections of multisite were examined in eight-month-old TN(-/-) mice and their WT littermates.Results Body weight between TN(-/-) mice and their WT littermates showed no significant difference.Cobb’s angle of both two-month-old and eight-month-old TN(-/- )mice increased significantly compared with their littermates (P<0.01).Cobb’s angle increased significantly with age in TN(-/-) mice (P<0.01).Asymmetric thoracic intervertebral disc structure and expanded and loose fibrous ring of intervertebral disc were distinct in TN(-/-) mice.Compared with their WT littermates,eight-month-old TN(-/-) mice demonstrated a significant decrease of BMD and BMC in the whole body,third lumbar vertebra and left femur (P<0.05).Besides,it was observed that TN(-/- )mice exhibited characteristics of thinner,sparse,and disordered arrangement or rupture of femur and lumbar vertebras bone trabecula with decreased osteoblasts and increased osteoclasts.ConclusionsTN(-/-) mice exhibit features of kyphosis and osteoporosis,which suggests that there is a close relationship between tetranectin and the normal growth and development of skeleton.TN(-/-) mice may be a potential animal model for kyphosis or osteoporosis and deserves further study.

【Key words】tetranectin;gene knock-out;kyphosis;osteoporosis;mice

(收稿日期:2015-08-31;编辑:沈玲)

【中图分类号】R682.2

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.006

上海市科学技术委员会基金(124119a1900);上海市卫生和计划生育委员会基金(20124339)

△Corresponding authorE-mail:wersong@aliyun.com