甘草甜素抑制小鼠慢性支气管炎模型肺组织中炎性细胞因子表达的作用机制



甘草甜素抑制小鼠慢性支气管炎模型肺组织中炎性细胞因子表达的作用机制

王宏英1,陈林2*

(1.赤峰市医院 感染科,内蒙古 赤峰024000；2.广西壮族自治区江滨医院 呼吸科,广西 南宁530022)

慢性支气管炎(chronic bronchitis,CB),在呼吸系统疾病中较为常见。吸烟、感染、环境污染及某些过敏因子等因素与其发病密切相关[1-4]。慢支的病理学特征为多种炎性细胞浸润、充血水肿和纤维增生,并且伴有不同程度的急性或慢性炎症反应存在于支气管壁和气管黏膜中。同时由于慢支患者支气管黏膜上皮细胞中分泌大量诸如白细胞介素(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor-α,TNF-α)等细胞因子,并且TNF-α可加重炎症反应的发生,由此我们可以推断,抑制或减少肺组织中炎性细胞因子的产生,对慢性支气管炎的发作可以起到缓解作用[5]。甘草甜素(Glycyrrhizin,GA) 药理作用表现为氢化可的松样的作用，可以抑制主要组织相容性复合体(MHC)、组织间黏附分子1(ICAM-1)、IL-1 和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的生成,诱导炎症细胞凋亡[6]。甘草甜素可通过抑制磷脂酶 A2 和脂加氧酶的活性来抑制花生四烯酸水解,减少 PGs 合成来而发挥抗炎作用[7]。但其对慢性支气管炎动物模型的炎性抑制作用,未见相关报道。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1造模动物选取健康成年雄性昆明种小鼠,体重(22±2) g,由吉林大学实验动物中心提供,合格证为吉医动准第0001号。常温饲养,普通饮食,自由饮水。所有实验动物参照《中华人民共和国动物保护法》以及美国国家卫生研究院(NIH)的相关条款。

1.1.2药品与试剂甘草甜素呈白色结晶粉末,(MDL号：MFCD00065194,经HPLC测定,纯度≥99.6%);兔抗β-actin、兔抗IL-1β多克隆抗体、鼠抗TNF-α单克隆抗体(美国 Santa 公司);HRP-DAB底物显色试剂盒、化学发光试剂盒均为美国 Santa 公司产品;硝酸纤维素膜(NC)为美国Millipore公司产品; 柯达感光片(北京鼎国生物技术有限公司)；蛋白预染 marker (加拿大 Fermentas 公司)；DTT、EDTA、TEMED、甘氨酸 (美国 Sigma 公司)；Tween-20 (美国 Amresco 公司)；滤纸 美国 bio-rad 公司。

1.1.3仪器冷冻离心机 28R 型 (德国 Heraeus 公司); DYCZ-24DN型双垂直电泳槽、DYCZ-40D型半干式转移电泳槽均为北京市六一仪器厂产品。低温冰箱(MDF190 型 日本 SANYO 公司)；扫描仪(美国 Amersham 公司)；转膜仪(TRANS-BLOT SD 型 美国 BioRad 公司)；Rea-time PCR 仪(Mx3000p 型 美国 Stratagene 公司)；凝胶成像分析系统(美国 Alpha-Innotech 公司)；多功能酶标仪(infinite M200 型 瑞士 Tecan 公司)；PCR 仪 (My cycler 美国 BIO-RAD)；激光共聚焦扫描显微镜 (日本 OLYMPUS 公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠CB造模、动物分组及给药实验动物小鼠50只,随机进行分组,共5组,分别为：空白对照组、CB空白组、甘草甜素高剂量组、甘草甜素中剂量组及甘草甜素低剂量组。饲养3天后,除空白对照组外,所有模型组进行熏烟+浓氨水法干预造模4周[8]。从第5周起,甘草甜素低、中、高剂量组分别灌胃甘草甜素 2.5 mg/kg,5.0 mg/kg,10.0 mg/kg,连续用药30天。

1.2.2Real-TimePCR检测 引物的合成使用Beacon designer 7软件设计IL-1β和TNF-α、以GAPDH为引物(表1),Blast检索验证其特异性。将各组肺组织标本Trizol试剂提取总RNA,以总RNA为模板反转录制备cDNA库。随后以cDNA库为模板,进行PCR扩增,每个反应体系中均加入GAPDH的一对引物作为PCR扩增的内参,反应条件：95℃ 30 s,58℃ 60 s,72℃ 60 s 40个循环。

表1　Beacon designer 7软件设计IL-1β和TNF-α、GAPDH引物

1.2.3炎性细胞因子Western blot测定将小鼠肺组织中的蛋白样品,用BCA试剂盒进行蛋白定量。取适量样品,加入等体积的2×上样缓冲液混匀,在100 ℃水中煮5 min,各组取15 μg样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(5%浓缩胶、12%分离胶)电泳分离,先用100 V电泳,待溴酚蓝至浓缩胶底后改用120 V电泳,当溴酚蓝距离分离胶底1 cm时停止电泳。分离的蛋白在250 mA条件下转膜150 min,将目的蛋白转移到NC膜上,用TBST洗膜,室温下用新鲜的5%脱脂奶粉封闭作用3 h,TBST洗膜后分别加入TBST稀释的一抗[β-actin(1∶1 000)和IL-1β或TNF-α(1∶400)]4 ℃过夜;TBST洗涤20 min×3次,加入TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000)室温孵育2 h,TBST洗涤20 min×3次,化学发光反应2 min,在暗室中感光。以β-actin作为内参,统计各组蛋白与β-actin吸光度的比值。

2结果

2.1Western-Blot法检测细胞炎性因子的表达

实验动物空白对照组中IL-1β/β-actin吸光度比值1.031±0.08,TNF-α/β-actin吸光度比值为1.284±0.11。模型组IL-1β/β-actin及TNF-α/β-actin吸光度比分别是2.149±0.09和3.791±0.15； 模型组与空白组两组IL-1β及TNF-α的表达明显升高(P<0.01)。用药组各组IL-1β和TNF-α呈现下降趋势,与空白组相比具有明显差异(P<0.01),呈现量效规律 (图1)。

2.2Realtime-PCR法检测IL-1β和TNF-α表达水平的影响

IL-1β和TNF-αmRNA在正常大鼠坐骨神经组织少量表达,慢性支气管炎模型中,IL-1β和TNF-αmRNA的含量上升,用药组各个剂量IL-1β和TNF-α表达呈下降趋势,与空白组相比具有显著差异(P<0.01),具有一定的量效关系。 用药组组间比较具有一定的差异性,高,中剂量组的上升量减缓且明显低于低剂量和对照组。各用药组经药物干预后IL-1β和TNF-α表达量呈下降趋势,与空白组相比具有显著性差异(P<0.01),具有一定量效关系(图2)。

图1　Real-Time PCR法检测甘草甜素对慢支小鼠肺组织细胞中IL-1β和TNF-α表达

图2　　Western-Blot法检测甘草甜素对慢支小鼠肺组织细胞

TNF-αIL-1βH1.528±0.13*1.161±0.06*M2.161±0.16*1.523±0.08*L2.778±0.14*2.012±0.10*Blank3.791±0.152.149±0.09Normal1.284±0.111.031±0.08

注： 各用药组肺组织IL-1β和TNF-α表达量呈下降趋势,与空白组相比具有显著差异(*P<0.01)

3讨论

最新研究证实,慢性支气管炎其病理特征为气道和肺的实质以及肺血管的慢性炎症和由炎症所导致的肺组织结构重塑。伴随气道炎症的不断进展将发展成以低氧血症为特征症状的肺气肿,从而导致血管重建引起肺动脉高压,导致肺心病。而慢性支气管炎以及肺气肿,CB等病情的持续进展与肺癌的发生和吸烟关系密切[9,10]。吸烟所导致的气道高反应性、免疫功能损害、感染次数增加是CB的主要病理机制，其所导致的炎性细胞聚集及活化后进一步加重气道损害；动物造模环境密闭,香烟的燃烧消耗氧气加之实验动物本身耗氧,形成相对缺氧环境；炎症相关细胞因子和慢性缺氧两种因素相互促进,IL-1β和TNF-α的表达水平增高。

有研究表明,自由基可导致CB患者支气管黏膜上皮细胞分泌大量的炎性细胞因子[13]。当发生炎性反应时,IL-1β和TNF-α存于肺支气管上皮细胞和肺泡中,二者表达在肺脏具有互相促进作用可加重CB症状[14-16]。本研究通过建立小鼠慢支模型,观察Realtime-PCR及Western-blot检测结果提示,空白组实验动物肺组织中IL-1β和TNF-α的表达水平呈上升趋势,与模型组对比,具有显著差异,由此我们发现慢性支气管炎动物模型肺部炎症反应与炎性细胞因子的高表达密切相关。实验结果提示：对于小鼠CB模型连续给药4周后,IL-1β和TNF-α的表达呈明显下降趋势。甘草甜素各用药组与模型组相比,中、高剂量组实验动物炎性因子IL-1β和TNF-α含量接近正常表达水平。由此我们可以推断,甘草甜素可能通过提高肺细胞中抗氧化酶的活性来抑制脂质过氧化对细胞膜的破坏作用,同时甘草甜素对CB肺组织中的白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等分泌细胞因子和炎症介质的表达具有明显的抑制功效,从而起到抑制肺组织中细胞炎性反应的表达,从而达到对CB的治疗作用。

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(收稿日期：2015-07-19)

文章编号：1007-4287(2016)03-0372-03

*通讯作者