甘露聚糖结合凝集素对白假丝酵母菌相态转化的影响及机制研究



甘露聚糖结合凝集素对白假丝酵母菌相态转化的影响及机制研究

宋家政1，高春海2

(1.兰陵县人民医院，山东 兰陵277799；2.临沂市人民医院 检验科)

白假丝酵母菌(Candidaalbicans，C.albicans)俗名白色念珠菌，是一种条件致病菌，广泛存在于人的口腔、上呼吸道、皮肤、肠道及阴道黏膜，是一种正常菌群，但当机体免疫力低下或菌群失调时，C.albicans 即是一种条件致病菌，当发生感染时，C.albicans 就完成不同的菌相转化，白假丝酵母菌就酵母相(Yeastform，Y)向菌丝相(Hyphalform，H)进行转化，菌丝相酵母菌是造成感染的关键因素，有学者研究显示菌相转化与念珠菌感染之间存在明显的相关性[1]，白假丝酵母菌菌相转化需要一定的物理化学剂免疫调节分子的调节才能有效的完成转化，相关物理化学条件研究较多，而对于免疫分子研究相对较少。

甘露聚糖结合凝集素(Mannan-bindinglectin，MBL)是一种存在于血浆中天然免疫调节因子，主要由肝细胞分泌[2]，近年来的报道显示甘露聚糖结合凝集素对机体的免疫应答调节发挥着重要的作用[3-4]。本研究探讨甘露聚糖结合凝集素(Mannan-bindinglectin，MBL)对白假丝酵母菌(Candida albicans，C.albicans)菌相态转化的影响及相关调节机制。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

试验所用试剂牛FITC、牛血清白蛋白、胰蛋白胨、琼脂糖及胰蛋白酶均购自 Sigma公司，酵母提取物购自Gibco 公司，所用检测仪器有流式细胞仪为美国 BD公司生产，倒置相差显微镜型号为TS100，为日本Nikon公司生产，核酸蛋白分析仪为德国Eppendorf公司生产。

1.2方法

1.2.1人甘露聚糖结合凝集素(Mannan-bindinglectin，MBL)的制备 具体操作步骤为1 mol/L CaCl2加入到新鲜冰冻人血浆1 000 ml，使其终浓度为20 mmol/L，37 ℃水浴2 h后4 ℃过夜，低温离心机离心沉淀20 min，弃上清液取沉淀经过滤过、洗柱、超滤、离心等操作制备纯化 MBL。

1.2.2C.albicans培养 采用常规方法将C.albicans 标准菌株置于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基中，28℃培养16 h后传代1次，在RPMI1640培养基上将传代培养物悬浮，浓度调整为5×107个/ml，行100 μl MBL(10 mg/L)处理的设为研究组，未行MBL处理的设为对照组，两组均置于37℃200 r/min 条件下震荡培养；间隔2 h观察C.albicans 菌丝形成情况，剩余的菌悬浮液进行RNA提取。

1.2.3FITC-MBL的制备采用透析法制备FITC标记MBL，具体操作方法:将MBL置于pH9.6的碳酸盐缓冲液进行透析过夜，用二甲基亚砜(DMSO)将FITC溶解并调节其浓度至1 mg/ml，根据比例在MBL蛋白溶液中滴入FITC-DMSO溶液，FITC/MBL=50 μg FITC/mgMBL，标记物中加入PBS溶液调节至2.5 mL，在室温避光条件下用磁力搅拌器搅拌2 h，4℃透析过夜，MBL终浓度调节至10 mg/mL。

1.2.4C.albicans与FITC-MBL结合试验将C.albicans置于Ca2+浓度分别为 1 mmol/L 、5 mmol/L的缓冲液或者EDTA液中，调整C.albicans菌液浓度为5×109个/L， 将浓度为10 mg/L的FITC-MBL加入到200 μl C.albicans菌液中， 并置于37℃培养箱避光培养半小时后用PBS 充分洗涤，未见FITC标记的MBL作为阴性对照组，各管加入200 μl流式洗液重悬细胞，流式细胞仪检测。

1.2.5C.albicans HWP1、DDR 48mRNA的表达检测首先提取C.albicans RNA，取研究组和对照组C.albicans 1×107个，根据Yeast RNAiso Kit 说明书提取RNA，用核酸蛋白分析仪测定提取的RNA的浓度及A260 nm/A280 nm 比值来判定RNA的纯度及完整性，当260 nm/A280 nm>1.8时，说明提取的RNA的纯度及完整性较高。根据情况将RNA的浓度调整为0.20 mg/ml。其次反转录合成cDNA，HWP1、DDR48 和β-actin引物合成是由公司合成(具体见表1)，分别提取的研究组和对照组C.albicans RNA 各1 μg，加入到反应体系中，使总反应体积在20 μL，首先37℃条件下，反应15 min合成 cDNA 第一链， 85℃条件下灭活反转录酶后终止反应，4℃条件下复性。最后PCR反应，反应体系中包括上、下游引物分别为0.8 μL，通过90℃条件下预变性 30 s，90℃条件下变性5 s，60℃条件下延伸30 s，并经过40次循环后进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，紫外灯下观察拍照，并用凝胶成像仪分析 DNA 片段的灰度值。

表1　RT-PCR基因引物序列及产物碱基数

1.3统计学分析

应用 SPSS17.0 软件包进行统计处理， 数据采用单因素方差分析方法，P<0.05判定差异有统计学意义。

2结果

2.1两组菌相转化比较

从图1中可以看出研究组经过MBL处理后2 h及4 h，C.albicans酵母相向菌丝相转化明显受到抑制，而在MBL处理8 h后，研究组菌丝生长速度与对照组基本一致。

2.2MBL抑制C.albicans菌相转化的机制研究

本研究结合试验结果显示，无论是C.albicans的酵母相还是菌丝相，MBL 在不含缓冲液中均不能与C.albicans 结合，在浓度为5 mmol/L Ca2+的结合体系中，MBL与C.albicans 结合能力明显高于在浓度为1 mmol/L Ca2+的结合体系中，说明MBL与C.albicans的结合与结合缓冲液中Ca2+浓度有明显相关性。见图2。

2.3MBL 对 C.albicans HWP1 、DDR48mRNA 表达的影响

从图3中可以看出，研究组加入MBL后2 h、4h，PCR扩增产物显示电泳带相对较弱，而8 h时，电泳带明显增强，说明加入MBL后2 h、4 h，C.albicans HWP1 mRNA 表达明显减少,而8 h时HWP1mRNA 表达增多，与对照组相比无明显差异；而对于DDR48 mRNA的表达，在MBL处理的各个时间段，研究组和对照组DDR48 mRNA的表达无明显差异；DNA片段灰度分析结果显示，研究组加入MBL 处理后2 h、4 h，HWP1的灰度值与对照组相比明显减弱，而在MBL 处理8 h时，HWP1的灰度值与对照组相比无明显差异，DDR48灰度值在MBL处理后2 h、4 h及8 h与对照组相比无明显变化，详见表1。

图1　倒置显微镜下观察甘露聚糖结合凝集素抑制

图2　MBL以Ca2+依赖的形式抑制C.albicans菌相转化

组别HWP1(x1000)2h4h8hDDR48(x1000)2h4h8h研究组2.0±0.33.8±0.57.9±0.62.8±0.23.5±0.54.5±0.3对照组3.9±0.47.3±1.18.1±0.72.5±0.53.3±0.74.3±0.2P<0.05<0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

图3研究组和对照组C.albicans HWP1 、DDR48mRNA表达比较(+代表研究组，-代表对照组)

3讨论

C.albicans 是一种致病真菌，在临床上较为常见，常驻于人的口腔、上呼吸道、皮肤、肠道及阴道黏膜，是一种正常菌群，但当机体免疫力低下或菌群失调时，C.albicans 即是一种条件致病菌。C.albicans有两种菌相，即酵母相和菌丝相，因此，又称二态性真菌，正常条件下，酵母相真菌无感染性，而菌丝相真菌感染性相对较强，因此，白假丝酵母菌感染的关键环节是酵母相向菌丝相的转化，在临床工作中，有效的控制真菌感染的切入点就是阻断酵母相向菌丝相转化。

甘露聚糖结合凝集素是一种C.albicans 感染早期肝细胞合成分泌的急性期蛋白，正常无感染条件下，人血清浓度为0.01-10 mg/L， 在急性期感染条件下，甘露聚糖结合凝集素在外周血的水平急速增加[5]，因此，甘露聚糖结合凝集素在感染免疫调节机制中起着重要的作用，有学者研究显示甘露聚糖结合凝集素对C.albicans 诱导的免疫反应有较强的抑制作用[6]。本研究结果显示，研究组C.albicans经过MBL处理后2 h及4 h，C.albicans酵母相向菌丝相转化明显受到抑制，而在MBL处理8h后，研究组菌丝生长速度与对照组基本一致，说明在C.albicans 感染早期，加入 MBL处理能够明显抑制C.albicans 酵母相向菌丝相的转化，达到抗感染的目的。而MBL是通过什么途径抑制C.albicans 菌相转化的，值得进一步探讨，有学者[3]研究结果，Ca2+在C.albicans酵母相向菌丝相转化的过程中起着重要的桥梁作用，本研究通过结合试验结果显示，无论是C.albicans的酵母相还是菌丝相，MBL 在不含缓冲液中均不能与C.albicans 结合，而随着结合缓冲液中Ca2+浓度升高，MBL 与C.albicans 的结合呈增强趋势，说明MBL与C.albicans的结合与结合缓冲液中Ca2+浓度有明显相关性，可见白假丝酵母菌无论是酵母相还是菌丝相菌体表面可能存在依赖Ca2+的依赖MBL 结合受体。

HWP1 是一种基因，主要负责C.albicans 菌丝胞壁蛋白的编码，有学者[7]研究显示HWP1主要通过编码甘露糖而与细胞壁的甘露糖以共价键的形式结合，从而促使C.albicans菌丝形成。本研究RT-PCR结果显示研究组加入MBL后2 h、4 h，PCR扩增产物显示电泳带相对较弱，而8 h时，电泳带明显增强，说明加入MBL后2 h、4 h，C.albicans HWP1 mRNA 表达明显减少，而8 h时HWP1mRNA 表达增多，与对照组相比无明显差异；DNA片段灰度分析结果显示，研究组加入MBL 处理后2 h、4 h，HWP1的灰度值与对照组相比明显减弱，而在MBL 处理8 h时，HWP1的灰度值与对照组相比无明显差异，说明甘露聚糖结合凝集素在早期能够有效的抑制白假丝酵母菌菌丝生长，具体机制可能是与抑制HWP1 基因表达有关。

DDR48 蛋白是白假丝酵母菌形成菌丝和包膜的必需蛋白，有学者[8]研究显示白假丝酵母菌形成菌丝和包膜的过程中DDR48 蛋白的表达量明显增加，另外也是一种损伤反应的标志，与DNA损伤有关[9]。本研究结果显示，在MBL处理的各个时间段，研究组和对照组DDR48 mRNA的表达无明显差异；DNA片段灰度分析结果显示，DDR48灰度值在MBL处理后2 h、4 h及8 h与对照组相比无明显变化，说明甘露聚糖结合凝集素抑制酵母相向菌丝相转化不是通过DDR48 基因介导的。

总之，甘露聚糖结合凝集素在C.albicans感染早期能够依赖Ca2+抑制酵母相向菌丝相转化，具体机制可能是通过减弱调控基因 HWP1 的表达。

参考文献：

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[3]王明永，张雅妮,雷鸣,等.MBL 抑制 Jurkat 细胞增殖和分泌 IL-2[J].现代免疫学，2010，30(6):448.

[4]陈阿德，王燕，张丽芸，等.甘露聚糖结合凝集素对人中性粒细胞功能的影响[J].南方医科大学学报,2013,20(1):14.

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[6]王明永,王凡平,郭晓芳,等.MBL 抑制白假丝酵母菌刺激THP1 /CD14 细胞产生TNF-α和IL-8[J].中华微生物学和免疫学杂志，2011，31(1):14.

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(收稿日期：2015-03-14)

作者简介：宋家政(1966-)，男，山东兰陵人，本科，副主任技师，主要研究方向：血液形态学、免疫学等。

文章编号：1007-4287(2016)03-0368-04