Nrf2在阿特拉津诱导小鼠心脏氧化应激中的作用

陈俊宇，索　琪，黄连弟，黄歆梅，刘　剑*，刘金莎

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.吉林大学临床医学院；3.吉林大学第二医院；4.吉林大学护理学院)



Nrf2在阿特拉津诱导小鼠心脏氧化应激中的作用

陈俊宇1，2，索琪3，黄连弟2，黄歆梅4，刘剑3*，刘金莎1*

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.吉林大学临床医学院；3.吉林大学第二医院；4.吉林大学护理学院)

摘要：目的观察阿特拉津(ATR)处理后小鼠心脏组织中过氧化产物的含量及Nrf2信号通路的活化，探讨ATR导致的心脏组织氧化应激损伤及保护机制。方法以玉米油溶解ATR，将32只雌性BALB/C小鼠随机分为0 mg/kg、5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg ATR剂量组，灌胃处理28 d，于第29 d处死小鼠取心脏组织匀浆并提取总蛋白，生化和Western blot方法检测心肌组织中过氧化产物含量、Nrf2信号通路相关蛋白的表达及抗氧化酶活性。结果ATR暴露小鼠心肌组织中NO、MDA含量增高；Nrf2及Keap1表达降低；Ⅱ相解毒酶表达增高；SOD、CAT、GSH-PX含量增加。结论ATR暴露可诱导小鼠心脏组织活性氧生成增多，Nrf2/ARE通路激活，通过上调Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶进行抗氧化防御。

关键词：阿特拉津；小鼠；心脏；氧化应激；Nrf2

(ChinJLabDiagn,2016,20:0355)

阿特拉津(atrazine,ATR )是全球使用范围最广的除草剂之一，化学名为2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪，广泛用于包括玉米，高粱，甘蔗等农作物中控制杂草和禾本科植物[1,2]。在中国目前估计每年使用量已超过几百万公斤，并造成了严重污染。ATR具有生物蓄积作用，被美国环境保护机构规定为可能的人类致癌物，同时被广泛认为是一种激素干扰物。最近几年，关于ATR诱发氧化应激损伤的研究逐渐引起学者们的重视[3]。

目前，据报道在多种物种如鲫鱼、大鼠等体内发现了ATR可以提高活性氧的浓度[4,5]。在肝脏、睾丸、附睾等多种组织中印证了ATR引起还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)浓度增高，抗氧化酶活性增高[6,7]，但是ATR对心脏组织是否能引起氧化应激反应的研究比较少见。

本实验通过小鼠为期28天的ATR经口给药，检测心脏组织匀浆的氧化应激状态和氧化酶活性，分析Nrf2通路的变化情况，探讨ATR是否导致心脏组织的氧化应激损伤及心脏自我保护的分子机制。

1材料与方法

1.1动物分组及处理

4周龄雌性BALB/C小鼠购自吉林大学白求恩医学院实验动物中心，随机分4组，每组8只。ATR以玉米油溶解，对照组以玉米油灌胃，设低、中、高三个实验组，ATR剂量分别为5 mg·kg-1、25 mg·kg-1

和125 mg·kg-1[8]，小鼠恒定温度、恒定湿度饲养于该动物中心，自由进食饮水，实验周期28天，第29天腹主动脉取血处死小鼠，立即取心脏组织。

1.2主要试剂及仪器

ATR购于美国sigma公司，纯度为99%。NO、MDA、SOD、CAT、GSH-PX生化检测试剂盒购于南京建成有限公司。Nrf2通路相关抗体购于美国Proteintech Group公司。羊抗兔IgG单克隆抗体及ECL试剂盒购于美国promega公司。其余试剂购于美国sigma公司。凝胶成像系统(2500R，中国Tanon)，电泳仪(AE-8800，美国Bio-rad)，分光光度计(VIS-7220，北京第二光学仪器厂)等仪器均为吉林大学基础医学院前列腺疾病防治研究中心实验室提供。

1.3生化法检测GSH-PX、MDA的浓度及CAT、SOD、NO的活性

取心脏组织100 g加入1 ml PBS冰上研磨，制备10%心脏组织匀浆，bradford法测定蛋白浓度，-20℃保存。先后按试剂盒说明书检测GSH-PX、MDA含量及CAT、SOD、NO活性。

1.4western blot方法检测NQO1、Nrf2、HO1、KEAP1蛋白表达

研磨心脏组织(液氮中)，裂解蛋白，12 000 r离心40 min，上清为匀浆，定量后取30 μg，加缓冲液，99℃水浴，SDS-PAGE电泳分离蛋白，100 V转膜1 h，封闭后TBST洗膜，封闭一抗、二抗，ECL发光法显色拍照。β-actin为内参，GIS凝胶成像分析系统分析目的蛋白光密度值，计算相对光密度(A)值。1.5统计学分析

2结果

2.1NO、MDA含量增高

检测心脏组织的氧化应激状态发现：相对于对照组，低剂量组ATR(5mg/kg)的心脏组织匀浆中MDA水平增高，高剂量组ATR(125mg/kg)的心脏组织匀浆中NO增高(P<0.05)，MDA含量明显增高(P<0.01)，提示ATR在小鼠心脏组织中诱导活性氧生成增加，见表1。

表1　心脏组织内MDA及NO含量

*：与对照组相比P<0.05

2.2Nrf2及Keap1表达变化

本实验为进一步分析ATR诱导活性氧增加后心脏组织的保护性变化，通过western blot法检测Keap1和Nrf2的蛋白表达情况，结果显示实验组 ATR处理后，5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg剂量组Nrf2的表达比对照组中降低，各实验组的Keap1的蛋白表达均降低(P<0.05)，如图1。

*：与对照组相比P<0.05; **：与对照组相比P<0.01

2.3Ⅱ相解毒酶表达增高

为了探讨Nrf2激活后Ⅱ相解毒酶的激活情况，我们检测了心脏组织中HO1和NQO1的表达情况。结果显示：相对于对照组，各实验组中ATR处理后的心脏组织中HO1含量均增加，各剂量组NQO1的含量增加，以上均具有统计学差异(P<0.05)，如图2。

2.4SOD、CAT、GSH-PX活力变化

上述实验发现Nrf2通路被激活，同样为了探讨心脏组织中抗氧化酶的活性，我们通过生化法检测发现：实验组(5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg)SOD和GSH-PX均较对照组水平增高，其中25 mg/kg和125 mg/kg 剂量组SOD明显增高，125 mg/kg剂量组CAT活力同样增高(P<0.05)，见表2。

*：与对照组相比P<0.05

剂量(mg/kg)SOD(u/mgprot)CAT(u/mgprot)GSH-PX(u/mgprot)052512537.24±10.6857.89±12.8*69.14±5.10**62.87±9.9**3.41±1.805.39±2.648.54±0.649.33±1.35*88.24±21.07132.73±27.65*121.59±18.54*128.58±29.71*

*：与对照组相比P<0.05;**：与对照组相比P<0.01

3讨论

ATR是在地表水和地下水中常见的污染物。事实上，农业径流和灌溉用水是ATR污染的主要来源[9]。大量的研究发现，ATR具有神经系统、免疫系统、内分泌系统、生殖系统等多系统毒性、氧化应激损伤及肿瘤促发作用[10-13]。最近几年，ATR诱发多组织产生氧化应激损伤已引起研究者们的重视。本实验ATR以每日灌胃的形式给药4周龄雌性BALB/C鼠，以玉米油为对照组，以浓度为5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR为实验组，饲养28天后处死小鼠，分析小鼠心脏组织的活性氧浓度和抗氧化防御系统状态。

高浓度的活性氧(reactive oxygen species,ROS)是破坏包括脂质膜、蛋白质和核酸等细胞结构的重要介质，称之为氧化应激损伤[14]。尽管细胞中存在抗氧化防御系统，可以抵消一定的ROS产生的氧化损伤，但在整个生命周期累积与氧自由基相关的DNA 、蛋白质和脂质的损伤在一些年龄依赖性疾病的发展中发挥了关键作用，如癌症，动脉硬化，关节炎，神经退行性疾病和其他疾病。为了探讨ATR在体内对卵巢组织的影响，本实验检测并分析了ATR剂量组和对照组中活性氧的水平。本实验主要检测了丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和一氧化氮(NO)。NO是主要的活性氧之一，MDA代表着细胞的脂质过氧化反应水平。结果显示：与对照组相比，5 mg/kg 的ATR给药28天后小鼠心脏组织匀浆中MDA水平增高，在125 mg/kg的高剂量ATR作用下NO含量增高，MDA含量明显增高，说明ATR导致小鼠发生氧化应激损伤。

细胞对抗氧化损伤的主要防御机制之一就是NF-E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factors 2，Nrf2)信号转导通路[15]。生理状态下，Nrf2与接头蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)相结合，使Nrf2被隔绝在细胞质。当氧化应激传感器Keap1遇到活性氧后，Nrf2解离释放[16]。Nrf2进入细胞核与ARE结合，参与调控抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的转录，保护细胞免受氧化损伤。

本实验首先通过western blot检测ATR作用28天后大鼠心脏组织中的Nrf2与Keap1蛋白含量，分析活性氧增多后，Nrf2信号转导通路的激活情况。发现ATR处理后，5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg剂量组Nrf2的表达比对照组降低(P<0.05)，各实验组的Keap1的蛋白表达均降低(P<0.05)。说明ATR可影响Nrf2信号通路的调控。

ARE的活化由Nrf2和Keap1紧密调控，Nrf2进入细胞核后，结合于ARE位点，激活下游的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶等细胞保护基因。Ⅱ相解毒酶的主要代表是血红素氧合酶-l(hemeoxygenase 1，HO1) 和 NAD(P)H：苯醌氧化还原酶(NAD(P)H：quinone oxidoreductase l，NQOl) 。本实验发现不同剂量的ATR均表现为诱导心脏组织HO1和NQO1含量增加，说明Nrf2活化后，Ⅱ相解毒酶的组织含量增加。同时本实验检测心脏组织的抗氧化酶含量同样发现浓度为5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg 的ATR上调SOD和GSH-PX水平，125 mg/kg剂量组中心脏组织的CAT活力同样增高，以上说明ATR诱导下通过Nrf2/ARE通路的活化，上调了抗氧化酶的表达。

综上，ATR诱导小鼠心脏组织中活性氧生成增多，进一步下调了Keap1的表达，激活了Nrf2/ ARE信号转导通路，使Nrf2进入细胞核与ARE位点结合，激活ARE下游的保护性基因，使Ⅱ相解毒酶HO1和NQOl表达上调，抗氧化酶SOD、GSH-PX和CAT的活力增加。本实验初步明确ATR作为心脏的氧化损伤因子，对心脏Nrf2/ARE抗氧化损伤防御系统具有强有力的诱导作用，为进一步分析ATR对心脏的损伤机制奠定了基础。

4结论

BALB/C小鼠ATR连续给药诱导心脏组织的活性氧生成增多，Nrf2/ARE通路被激活，通过Ⅱ相解毒酶HO1和NQOl及抗氧化酶SOD、GSH-PX和CAT表达上调进行抗氧化防御。

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The role of Nrf2 in atrazine induced oxidant response of heart in mouse

CHENJun-yu,SUOQi,HUANGLian-di,etal.

(ClinicalCollageofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the contents of peroxidation product and the activation of Nrf2 signaling pathway in heart tissue of mouses treated by atrazine (ATR),and to evaluate the mechanism of ATR on heart tissue oxidative stress injury and its protection mechanism.Methods32 female BALB/C rats were randomly divided into 4 groups,treated by a daily gavage of 0 mg/kg (control group) and 5,25 and 125 mg/kg (experiment groups) atrazine dissolved in maize oil respectively for 28 days,and the animals were sacrificed on day 29.The heart tissues were collected to homogenize and isolate the total protein.Biochemical process and Western blot were employed to detect the contents of peroxidation product,the expressions of Nrf2 signaling pathways related proteins and the activation of antioxidase in the heart tissues.ResultsAfter treated by ATR,the content of NO and MDA were increased;Nrf2 and Keap1 were decreased;Ⅱ phase detoxifying enzymes was increased;SOD,CAT,GSH-PX were increased.ConclusionAfter treated by ATR,the reactive oxygen in heart tissue was increased, and the Nrf2/ARE signaling pathway was activated to resist the oxidation through up-regulating the expression of Ⅱ phase detoxifying enzymes and antioxidase

Key words:atrazine;mouse;heart;oxidative stress;Nrf2

(收稿日期：2015-10-19)

文献标识码：A

中图分类号：R992

文章编号：1007-4287(2016)03-0355-04

*通讯作者