亚低温治疗对大鼠缺血再灌注损伤脑组织中Survivin和Bcl-2基因表达的影响

姜尧佳,徐振宇,王泽宇,刘永刚,魏春杰*,盛宝英

(1.佳木斯大学附属第一医院 神经内科，黑龙江 佳木斯154000；2.佳木斯大学基础医学院)



亚低温治疗对大鼠缺血再灌注损伤脑组织中Survivin和Bcl-2基因表达的影响

姜尧佳1,徐振宇2,王泽宇1,刘永刚1,魏春杰1*,盛宝英1

(1.佳木斯大学附属第一医院 神经内科，黑龙江 佳木斯154000；2.佳木斯大学基础医学院)

摘要：目的观察亚低温治疗对大鼠缺血再灌注损伤脑组织细胞中Survivin和Bcl-2基因表达的影响。方法90只wister大鼠制作大脑中动脉闭塞(MCAO)脑缺血再灌注损伤模型。随机将大鼠分为假手术组，对照组(建模后常温处理)和观察组(建模后亚低温处理)。将对照组和观察组大鼠大脑中动脉缺血处理2，4，8小时，再灌注3 h，24 h，48 h，7 d，14 d后处死。亚低温组于缺血20分钟后亚低温处理5小时。用免疫组织化学法检测Survivin和Bcl-2在缺血再灌注损伤脑组织细胞中的表达情况。结果大鼠神经功能评分：假手术组(0.15±0.04)分，对照组(3.54±0.36)分，观察组(3.72±0.55)分。亚低温处理后Survivin和Bcl-2蛋白的表达增加。结论亚低温治疗后的大鼠脑缺血组织中的Survivin和Bcl-2蛋白表达增加，对大鼠的神经细胞有保护作用，改善大鼠再灌注治疗的预后。

关键词：亚低温治疗； Bcl-2； Survivin； 缺血再灌注损伤

(ChinJLabDiagn,2016,20:0352)

脑缺血会造成神经细胞的程序性死亡和坏死。亚低温治疗可以调控凋亡相关蛋白的表达，促进Survivin和Bcl-2蛋白的表达，抑制神经细胞的凋亡，减轻缺血再灌注对脑组织的损伤，促进损伤神经功能恢复。Benjamin发现亚低温治疗对大脑缺血再灌注损伤有治疗作用[1]。本次研究着重探讨亚低温治疗对 大鼠脑缺血再灌注损伤中Survivin和Bcl-2蛋白的表达影响。

1材料与方法

1.1材料佳木斯大学动物实验中心提供的日龄为40 d的Wister大鼠90只，平均体重 (215±13)g。随机分为假手术组，对照组(建模后常温处理)和观察组(建模后亚低温处理)，每组各30只。

1.2方法

1.2.1建模方法用改良longa法建立大鼠大脑缺血再灌注模型：用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，固定，消毒，备皮，分离左侧颈总动脉，颈外动脉，颈内动脉和迷走神经。根部结扎颈内动脉；近心端结扎颈总动脉，颈总动脉远端打一松扣，然后用动脉夹暂时夹闭。在靠近颈总动脉远心端结扎处剪一V形小口，将鱼线圆球端伸入颈总动脉，切口远端用丝线结扎[2]。打开动脉夹，轻轻将圆球推入颈内动脉入颅方向，稍有阻力即停止。此时圆球端在大脑中动脉开口处，距离分叉处18 mm左右，将皮肤缝合，线残端留于体外，并局部使用抗生素防止感染。再灌注时，将圆端拔出至颈总动脉开口结扎处，模拟缺血的脑组织的再灌注治疗。假手术除不进行缺血处理外，操作与另外两组相同。

1.2.2实验方法观察组在大脑缺血处理20 min后用冰袋对脑部进行亚低温处理5 h，使脑组织温度保持在32-33℃。对照组和观察组在缺血4 h后，将各组大鼠随机分为5个亚组，每个亚组6只，分别在对照组和观察组再灌注3 h，24 h，48 h，1周，2周后处死。假手术组在上述五个时间点随机选择6只大鼠处死。

1.2.3造模成功评分[3]0分:无神经缺损症状；1分:对侧前肢持续屈曲；2分:转圈实验阳性；3分:行走时向一侧倾倒；4分:行走困难，意识障碍；5分：死亡。

1.2.4脑组织切片标本制作用1%戊巴比妥钠将大鼠过度麻醉，4%多聚甲醛灌注后，断头取脑，在视交叉前后2 mm处做冠状切片，将所取脑组织石蜡包埋，常规切片。

1.2.5Survivin和Bcl-2蛋白免疫组化检测利用免疫组织化学法(S-P法)对切片标本中Survivin和Bcl-2蛋白的表达进行检测。Survivin和Bcl-2蛋白一抗采用小鼠抗大鼠的Survivin和Bcl-2单克隆抗体，试剂盒购于SANTA CRUZ 公司。Survivin阳性和Bcl-2阳性细胞的胞浆胞核表达均呈棕黄色。每张切片在400倍镜下取4个不重叠视野，每个视野计数100个细胞，对Survivin，Bcl-2蛋白阳性表达细胞进行计数，并计算平均值。

1.3统计学方法采用SPSS16.5软件对所有实验所得数据进行处理，对计数资料用χ2检验，对计量资料用t检验，P<0.05有显著差异。

2结果

2.1各组大鼠神经功能评分大鼠死亡情况：假手术组0只，对照组17只，观察组4只，假手术组(0.15±0.04)分，对照组(3.54±0.36)分，观察组(3.72±0.55)分。

2.2Survivin和Bcl-2蛋白免疫组化结果假手术组极少表达(<1个)，故未计入，常温缺血组及亚低温缺血组Survivin和Bcl-2蛋白在神经元，少突胶质细胞，星形胶质细胞的胞浆中表达(P<0.01)。Survivin和Bcl-2蛋白的表达随再灌注治疗时间延长而增加，48 h时达到最大值，后呈下降趋势，观察组各时间点Survivin蛋白和Bcl-2蛋白阳性表达数均显著高于对照组(P<0.01)。见表1和表2。

表1　Survivin蛋白阳性表达情况(个)

注：与对照组相比,*P<0.01

表2　Bcl-2蛋白阳性表达情况(个)

注：与对照组相比，*P<0.01

3讨论

脑卒中的再灌注治疗有狭窄的治疗时间窗。因大脑是耗氧量最大的器官，短时间的缺氧即可造成脑细胞的变性，凋亡，坏死[4]。延长治疗时间窗可以有效的改善脑卒中患者的预后。

亚低温治疗是使局部组织温度在32-34℃[5]。研究表明亚低温可以调控细胞的凋亡，降低大脑的耗氧量，调节脑血流，减少脑组织的炎症反应，减少脑细胞的损伤，减轻缺血再灌注对脑组织的损伤，可以显著延长治疗时间窗。

凋亡抑制蛋白(IAP)是一种抑制细胞程序性死亡的细胞因子，它具有高度的遗传保守性[6]。Bcl-2和Survivin蛋白是重要的抗细胞凋亡蛋白。提高Bcl-2和 Survivin在细胞中的表达可以有效的恢复神经细胞的功能，减少神经细胞的损伤。国外研究表明，亚低温可以提高梗死灶中Bcl-2和Survivin 蛋白的表达。

Bcl-2家族基于机体保护机制在缺血早期表达增加，对神经元有抗缺血损伤作用，保护神经细胞[7]。随着缺血时间延长，Bcl-2蛋白的表达减少，凋亡和坏死的神 经细胞增加，激活凋亡级联反应，神经细胞损伤加重。Bcl-2蛋白通过减少细胞内钙超载，抑制细胞凋亡信号通路的激活。本次实验的观察结果表明，亚低温处理可以增加Bcl-2蛋白的表达，减少脑细胞的凋亡和坏死，有利于缺血再灌注后脑细胞的功能恢复。

Survivin蛋白也抑制细胞的凋亡。Edward等科学家发现在大鼠的大脑缺血再灌注模型中，Survivin蛋白会在缺血病灶和病灶周边特异性的表达增加。 Survivin蛋白的表达增多由PKt / AKT 信号通路激活，有利于抑制神经细胞的凋亡，减轻缺血再灌注损伤[8]。本次实验可观察到，亚低温可以诱导Survivin蛋白表达增多，减轻缺血再灌注对 神经细胞的损害。

实验中，用亚低温治疗大鼠的生存率明显提高，神经损害症状明显减轻。说明亚低温治疗可以通过增加Bcl-2和Survivin 蛋白的表达，减少脑神经的凋亡。Lifei在研究中认为这可能与亚低温选择性的调控蛋白合成有关，具体机制有待进一步研究[9]。故亚低温可以有效延长 脑缺血的有效治疗时间窗，在临床应用中可能改善脑卒中病人的预后，这与闫晓明的研究结果一致[10]。

从本研究结果中可以看出，亚低温治疗后的大鼠脑缺血组织中的Survivin和Bcl-2蛋白表达增加，对大鼠的神经细胞有保护作用，改善大鼠再灌注治疗的预后。

参考文献：

[1]Benjamin Bonneau,Julien Prudent,Nikolay Popgeorgiev,et al.Non-apoptotic roles of Bcl-2 family:The calcium connection[J].BBA-Molecular Cell Research,2013,183(37):1352.

[2]Yongjuan Gu,Shidai Jin,Feng Wang,et al.Clinicopathological significance of PI3K,Akt and survivin expression in gastric cancer[J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2014,11(8):1680.

[3]Zhang Peng,Cheng Guo-Qiang.Research progress in mild hypothermia treatment of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy].[J].Chinese journal of contemporary pediatrics,2013,15(10):1390.

[4]杜立树,平龙玉,张曼俐.缺血缺氧性脑病新生儿免疫功能的变化及临床意义分析[J].中国实验诊断学,2015,19(3):395.

[5]Liqun Wang,Yanyan Kang,Wenyun Zheng,et al.Effect on apoptosis and cell cycle of recombinant double negative dominant mutation Survivin (T34/117A) in breast cancer cell B-Cap-37[J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2013,31(13):146.

[6]Min-Sung Lee,Ji-Hyang Ha,Ho Sup Yoon,et al.Structural basis for the conserved binding mechanism of MDM2-inhibiting peptides and anti-apoptotic Bcl-2 family proteins[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2014,15(1):1490.

[7]赵金川,赵燕,侯坤,等.联合应用氯喹增加人胶质瘤细胞U343细胞对Bcl-2抑制剂ABT737的敏感性[J].中国实验诊断学,2014,18(9):1402.

[8]Haidar Akl,Tamara Vervloessem,Santeri Kiviluoto,et al.Parys,Humbert De Smedt,Geert Bultynck.A dual role for the anti-apoptotic Bcl-2 protein in cancer:Mitochondria versus endoplasmic reticulum[J].BBA-Molecular Cell Research,2014,43(13):1880.

[9]Lifei Yu,Yuanfeng Zhou,Yi Wang.Effect of mild hypothermia on glutamate receptor expression after status epilepticus[J].Epilepsy Research,2012,10(1):148.

[10]闫晓明,刘庆波,罗毅男,等.亚低温方法抗重度颅脑损伤作用的临床研究[J].中国实验诊断学,2003,7(6):534.

Effect of mild hypothermia on the expression of Survivin and Bcl-2 gene in brain tissue of rats with ischemia reperfusion injury

JIANGYao-jia，XUZhen-yu，WANGZe-yu，etal.

(DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity，Jiamusi154000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of mild hypothermia therapy on regulation of cerebral ischemia reperfusion injury in rats and the expression of Survivin gene in Bcl-2 tissues and cells.MethodsRandomly selected 90 Wister rats are used for establish middle cerebral artery occlusion (MCAO) in cerebral ischemia reperfusion injury model.The rats were divided into sham operation group,control group (normothermic ischemia group) and observation group (mild hypothermia ischemia group).In the observation group and the control group of rats with middle cerebral artery ischemia treatment 2,4,8 hours,then reperfuse 3h,24h,48h,1 week,2 weeks.Mild hypothermia group reperfuse for 5 hours after ischemia mild hypothermia treatment for 20 minutes.Detection of Survivin and Bcl-2 cells by immune group content.ResultsThe score of neural function in rats:sham operation group is (0.15±0.04),control group is (3.54±0.36),the observation group (3.72±0.55) points.Comparison between groups with great difference.Mild hypothermia treatment increases the expression of Survivin and Bcl 2 gene.ConclusionThe expression of Survivin and Bcl-2 protein increased in tissue of rats after mild hypothermia treatment,and the treatment has a positive effect on rat neural cell,which can improve the prognosis of rats.

Key words:Mild hypothermia treatment;Bcl-2;Survivin;Ischemia reperfusion injury

(收稿日期：2015-06-27)

作者简介：姜尧佳(1976-),男,内科主治医师,医学硕士,研究方向：缺血性脑血管病的防治。

文献标识码：A

中图分类号：R364.1+2

文章编号：1007-4287(2016)03-0352-03

*通讯作者

基金项目：佳木斯大学科技项目(S2013-039)