基于反向对接法的大黄酸抗炎作用的分子机制研究*

徐佑东　张艳　孟宪丽　曾勇　王平

(成都中医药大学，四川 成都　611137)



论著

基于反向对接法的大黄酸抗炎作用的分子机制研究*

徐佑东张艳孟宪丽曾勇王平△

(成都中医药大学，四川 成都611137)

摘要目的：利用反向对接技术以大黄酸为研究对象筛选出大黄酸的炎症靶标蛋白。方法：获取Toll样受体/核因子(4TLR4/NF-κB)、p38促分裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases，P38 MAKP)和Janus激酶-信号转导转录激活因子(Janus kinase 2/ signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)3条炎症通路上的30个蛋白的晶体学结构以及大黄酸的化学结构；利用AutoDockTools对所有晶体学结构进行标准化处理；通过AutoGrid对靶标蛋白的活性位点进行计算；利用AutoDock对大黄酸进行反向对接模拟实验；对得到的对接结果进行筛选，根据对接自由能的高低，筛选出亲和力高的靶蛋白；对筛选得到的靶蛋白进行作用力分析并作图。结果：反向筛选得到3个与大黄酸具有高亲和性的靶蛋白，分别为P38、PI3Kγ、JAK2。结论：大黄酸是通过抑制P38、PI3Kγ、JAK2靶蛋白，进而阻碍炎症信号传递，影响下游蛋白的表达，发挥抗炎作用。

关键词：大黄酸；分子对接；JAK2/STAT3通路；NF-κB通路；炎症；AutoDock

大黄酸为中药大黄Rheum palmatum L.蒽醌衍生物中的活性成分，具有显著抗炎作用[1]。大量研究显示大黄酸能通过TLR4/NF-κB信号通路抑制NF-κB转录[2]，并且其还可以显著下调LPS诱导的iNOS mRNA的表达水平，降低LPS所诱导的IL-1β、IL-6、IL-8表达量升高[3-5]。虽然大黄酸抗炎机制得到一定进展，但是大多数研究还停留在动物以及细胞阶段，仅通过蛋白表达量以及抑制率的高低来评价大黄酸的抗炎效果。而大黄酸是竞争性抑制了上述蛋白发挥了抗炎作用，还是与细胞膜表面受体(TLR4、TNFR)或细胞内的信号蛋白(NF-κB、TAK1、MyD88、IKKγ等)竞争性结合，从而阻断信号通路，抑制下游炎症细胞因子表达却知之甚少。因此，有必要在分子水平上对大黄酸进行深入的探究。

在炎症应答过程，TLR4/NF-κB信号通路涉及到多条信号通路的共同参与完成，并且信号通路间相互协同作用，增强炎症的表达。其中，TLR4/NF-κB信号通路、JAK激酶2/信号转导和转录激活因子3(Janus kinase 2/ signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)以及P38丝裂原激活蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases，P38 MAKP)在炎症应答过程中不但起着重要作用而且彼此间联系紧密。实验显示，NF-κB的活化将诱导一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)、环氧酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)、金属基质螯合蛋白酶(Matrix metallopeptidase 9，MMP-9)的表达[6-9]。在LPS刺激下，P38蛋白被激活将迁移进入细胞核调控NF-κB的表达，使NF-κB介导的下游蛋白表达增加[10]。另外，JAK2/STAT3信号通路也能通过PI3K/PDK1/Akt 通路来调控NF-κB的表达，同样TLR4/NF-κB信号通路也可以利用PI3K/Akt/mTOR通路与STAT3协同作用，促进IL-6、IL-10、IL-11、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27等炎症因子活化[11,12]。因此，完整的大黄酸的抗炎实验需要进行多个蛋白的活性抑制实验，从而获得详尽蛋白活性抑制信息。

目前，证明配体与靶蛋白相互作用的最直接的手段主要包括：蛋白晶体学解析、蛋白荧光猝灭以及分子反向对接技术[13-15]。蛋白晶体学解析对蛋白纯化要求极高而且成本昂贵，因此只能对单个明确的靶蛋白展开研究。荧光淬灭实验，虽然对蛋白要求较低，但是若进行多靶标蛋白的验证，将会导致实验周期过长，实验量增大，从而导致实验成本过于高昂。

反向对接技术是目前较为准确的靶蛋白筛选手段，该技术以分子对接技术作为基础，以单一或者多个配体作为研究对象，对大批量的蛋白进行对接筛选，再根据对接能量高低排序并分析，找出潜在的靶标蛋白。该技术手段已经得到广泛运用[16]，为药物的重新定义以及药物设计做出了巨大贡献。因此在进行实验之前，首先运用分子反向对接技术筛选出潜在的靶标蛋白(反向对接技术[17,18])，选取具有较高亲和力的靶标蛋白，再对这些蛋白进行蛋白水平实验，这样可以减少实验所需靶标蛋白数量提高实验效率，同时也能在保证可信度的基础上降低实验成本。

基于此思路及结合大黄酸抗炎机理的研究现状，本文利用反向对接技术，对炎症通路相关的30蛋白进行反向对接，以筛选出大黄酸抗炎作用的直接作用靶蛋白，并对大黄酸与靶标蛋白间相互作用进行分析，以期探究大黄酸抗炎作用的分子机制，并为以大黄酸为母核的新型抗炎先导化合物的结构设计提供相关方向。

1材料与方法

本实验以TLR4/NF-κB、P38、JAK2/STAT3炎症通路上30个蛋白为研究对象(相关蛋白详见表1)，所有蛋白的晶体结构均从RCSB Protein Data Bank(PDB)上下载并保存为PDB格式。晶体结构中的所有杂原子、结晶水以及本身结构解析时所携带的配体全部去除，并添加极性氢，计算高斯电荷。以上所有优化过程均在AutoDock Tools-1.5.6rc3软件上完成。

大黄酸的化学结构从PubChem上获取，文件保存为3D SDF格式。配体结构通过Swiss-PDB Viewer V.4.02中的GRO-MOS96模块进行MM-2能量优化。

将上述处理的蛋白受体作为大黄酸(配体)反向对接与虚拟筛选的酶靶。在模拟过程中，配体允许自由旋转。AutoGrid模块利用对应配体原子(C，N和O)的探针原子在靶点蛋白的活性区域进行探测并生成势能图。AutoDock选择拉马克遗传算法(Lamarckian genetic-algorithm，GA)来模拟计算配体与靶点蛋白活性位点间的亲和力。对接过程选用半柔性对接，运行次数为100次，最大能量评价为5000000，种群数量为150，其余参数采用默认值。

最后，选用PyMOL1.5.0.4(Python molecule，PyMOL)与LigPlot+进行实验结果分析。

2结果

2.1对接方法的检验

为了检验对接方法的可靠性，选取4个晶体结构(PDB ID:2B7A,3HR4，3UVQ，4EZJ)进行重复对接实验。对接结果显示，配体对接的构象与原晶体结构上配体构象相似，并且根据检验标准，重复对接实验的RMSD值均小于2.0Å，说明重复对接实验是成功的，对接方案是可信的。

(A)2B7A

(B)3HR4

(C)3UVQ

(D)4EZJ图1　重复对接结果注：蓝色的配体为晶体结构上的原配体，黄色配体为重复对接构象，两个构象叠合对比显示。

2.2大黄酸反向对接结果

大黄酸与3条炎症通路靶标蛋白的对接结果显示，大黄酸对蛋白激酶具有更高的亲和力，尤其是对P38、PI3Kγ(PDB ID：3UVQ、4EZJ)的ATP催化位点的结合能力最强，对接自由能分别为：-9.05、-9.01 kcal·mol-1，抑制常数分别为250.48、230.75 nM·L-1。另外，大黄酸与JAK2(PDB ID：2B7A)靶点蛋白的结合能力稍弱，自由结合能为：-8.08 kcal·mol-1,抑制常数为1.19 μM·L-1。

表1　大黄酸与炎症靶标蛋白对接数据

注：*：I类构象为最优构象相似的对接结果，相似构象间的能量差异不大于-1 kcal·mol-1；△：对接自由能反应了配体与蛋白之间的亲和力，对接自由能越低，亲和力越高。

此外，大黄酸对TAK1(PDB ID：2EVA)、IA型PI3K蛋白激酶家族(PI3Kα：4JPS，PI3Kβ：4BFR， PI3Kδ：4EZJ)、Akt1、Akt2、IKKβ(PDB ID：3MVH、2JDR、4KIK)也有较高的亲和性。另外，大黄酸与COX-2、iNOS(PDB ID：3NT1、3HR4)也具有较高亲和力。

2.3大黄酸与关键靶标蛋白作用模式

如图2所示，大黄酸的羟基、羰基以及羧基是形成氢键作用的位点，这些氢键是稳定大黄酸与ATP位点相互作用的关键因素。由于大黄酸共轭结构，其与JAK2的Tyr931之间还产生π间还堆积效应(如图C2所示)。大黄酸与P38、PI3Kγ、JAK2 ATP位点的稳定结合的另一个作用力——疏水作用，为大黄酸的蛋白亲和做出了较大贡献。如图所示，大黄酸与3个蛋白上的构成ATP位点的残基形成疏水作用，并且与活性区域形成构型互补，从而牢牢的结合在活性位点上。

图2　大黄酸与P38、PI3Kγ、JAK2的对接模式图A1、A2为大黄酸与P38 ATP位点的作用模式；B1、B2为大黄酸与PI3Kγ ATP位点的作用模式；C1、C2为大黄酸与JAK2 ATP位点作用模式。在3D示意图中，靶蛋白以二级结构显示，大黄酸以球棍模型显示，残基以棍棒模型显示。在平面示意图中，辐射状弧形代表疏水作用的残基，虚线代表氢键，球棍模型为大黄酸。

3讨论

分子反向对接技术是基于分子对接的逆运用，其以配体作为研究对象，蛋白作为靶标进行靶蛋白的筛选。本实验选择NF-κB、P38、JAK2/STAT3 3条通路上的30个蛋白进行反向对接。结果显示，大黄酸与P38、PI3Kγ、JAK2靶蛋白具有较高亲和力。

P38是炎症信号通路上的关键靶蛋白，其能够进入细胞核调控多种核转录因子，如环磷腺苷反应元件链接蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、转录活化因子-2(Activated transfer factor 2，ATF-2)、NF-κB等转录基因的表达，还能影响炎性细胞因子，如TGF-β1、TNF-α、IL的合成，并且参与炎症细胞的活化[19]。 Huang J、Alam JJ、Studer RK等研究证实P38激酶的抑制制影响NF-κB的转录，降低iNOS、COX-2、IL的表达[20,21]。 PI3K激酶是NF-κB通路与JAK2/STAT3通路的“交汇”，磷酸化的PI3K可以通过PDK1/Akt通路激活NF-κB并促进iNOS的表达。研究显示[22,23]，PI3Kγ在免疫细胞内高度表达并且在炎症应答过程中起着重要的介导作用。Hee Jung Kim和Randall S. Frey的研究发现[24,25]，PI3Kγ的抑制能够显著减少LPS所引起的氧化自由基的产生，并且极大程度上抑制的NF-κB的活化，减少下游炎症细胞因子的表达，从而缓解炎症。JAK2/STAT3通路可介导多种细胞因子的转导，JAK2的磷酸化可激活STAT3进入细胞核并介导多种炎症因子生成，如iNOS、MMP-9、COX-2、IL-6、IL-1β、PG。

对接结果表明P38、PI3Kγ、JAK2的ATP位点极有可能为大黄酸的直接作用靶位，这一直接作用的继发效果表现出阻碍TLR4/NF-κB信号通路，降低NF-κB的活化等作用。而大黄酸对相关下游蛋白及核转录的影响已有大量文献报道[26,27]。

能量分析表明，大黄酸与相关蛋白激酶结合能力均较强，如P38、PI3Kγ、JAK2、IA型PI3Ks、Akt1、Akt2、TAK1、IKKβ等。这可能与人类激酶的ATP区域(激酶区域)都有着序列和结构的高度保守性有关[28]。在ATP与激酶的结合过程中，高度共轭腺嘌呤负责与激酶区域牢固地结合，而大黄酸蒽醌母核的高度共轭的特性与腺嘌呤相似，所以大黄酸可以像ATP的腺嘌呤环一样的结合到激酶区域，并且ATP区域狭窄的构象特点也使得大黄酸可以有效地形成构型互补，从而与蛋白激酶结合阻碍炎症应答，发挥抗炎作用。

从对接受力分析，大黄酸的共轭结构可与残基之间形成π-π堆积以及cation-a相互作用，并且大黄酸的多羟基、羰基结构负责与残基形成重要的氢键作用，这些特征性结构在大黄酸的稳定结合过程中发挥着重要作用。这些结构特征提示在设计P38、PI3Ks、JAK2等激酶的抑制剂时，通过加入1、8位的羟基基团，以及9、10的羰基基团可以提高配体的亲和力，并且降低配体的旋转势能增加共轭度，将有利于配体与蛋白激酶ATP位点的结合。

综上所述，炎症通路靶位反向对接实验表明大黄酸抗炎作用的直接靶蛋白可能为胞内P38、PI3Kγ和JAK2的高度保守ATP位点。这一结果为进一步明确蒽环类物质的抗炎机制提供了新的研究侧重点，也为相应新型先导化合物合成提供了初步的构效关系指征。

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Study on anti-inflammatory mechanism of rhein based on reverse docking method*

Xu You-dong, Zhang Yan, Meng Xian-li, Zeng Yong, Wang Ping△

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137)

AbstractObjective：To investigate the mechanism of anti-inflammation of rhein through the approach of reverse docking, which was utilized to dock rhein with proteins in the signal pathways of NF-κB、P38 and JAK2/STAT3. Methods: Thirty proteins of NF-κB、P38 and JAK2/STAT3 pathway were obtained from PDB website, the structure of rhein was obtained from PubChem website. All the proteins were processed with standardization disposal of AutoDockTools. Then AutoGrid was utilized to calculate the grids of active sites. The docking result has been ranked according to docking energy, for the purpose of selecting out the proteins with high affinity for rhein. Results: Three target proteins including P38, PI3Kγ and JAK2 were found to interact with rhein with high affinity. Conclusion: Anti-inflammation of rhein relates to its function of competitive inhibition for the 3 target proteins, and the behavior of rhein results in the obstruction to signal pathways. Finally the purpose of treatment for inflammation has been achieved by this method.

Key Words:Rhein; Molecular docking; Pathway of JAK2/STAT3; Pathway of NF-κB; Inflammation; AutoDock

(收稿日期：2016-1-20)

作者简介：徐佑东，男，在读研究生，主要从事药理学研究，E-mail：xydarticle@hotmail.com。△通讯作者：王平，男，副教授，主要从事中药药代动力学研究，Email：viviansector@aliyun.com。

*基金项目：国家自然科学基金项目(编号：81274111)