无核白甜葡萄酒产香酵母菌种筛选及其发酵性能研究

雷　静，吴　斌，郭　峰，韩　琛，陈　雅，阿依加马丽（新疆农业科学院吐鲁番农业科学研究所，新疆吐鲁番838000）



无核白甜葡萄酒产香酵母菌种筛选及其发酵性能研究

雷静，吴斌，郭峰，韩琛，陈雅，阿依加马丽
（新疆农业科学院吐鲁番农业科学研究所，新疆吐鲁番838000）

摘要：葡萄酒的香气是评判葡萄酒品质一个重要的感官指标，芳香物质也是构成葡萄和葡萄酒的重要成分。无核白葡萄属于白皮葡萄，自身带有的果香味淡薄。这就需要在酿造工艺上加以改进，采用产香酿酒酵母是可靠安全的增香手段。本研究通过对无核白葡萄自然发酵液分离初筛，筛选出1株产香较好的酵母菌株，命名为W4。同时对筛选出的W4产香酵母菌种进行发酵性能参数确定。通过实验分析得出：W4菌株最适pH值为3、最适发酵温度为20℃、最适初始糖度为230 g/L，发酵所得葡萄酒产酯总量为7.335 g/L。筛选出的菌株可以有效、明显地提高葡萄酒的总酯含量。

关键词：无核白葡萄酒；产香酵母；筛选；发酵；性能

葡萄产业是吐鲁番地区的支柱产业之一，主栽品种为无核白葡萄。据统计，2014年吐鲁番地区种植无核白葡萄约45万亩，占吐鲁番葡萄面积的90 %以上，是我国最大的无核白葡萄种植地区。无核白葡萄，颗粒椭圆，成熟时晶莹碧透，犹如一串串挂着的绿色珍珠，皮薄肉脆，汁多味甜，鲜果含糖量达24 %以上，是葡萄中的佳品。无核白葡萄富含白藜芦醇及黄酮类物质以及人体易于吸收的磷、铁、钙、镁、钾等矿物质和多种维生素，具有生产高档葡萄酒得天独厚的条件。吐鲁番地区无核白葡萄主要以鲜食和制干形式进入市场，随着吐鲁番地区无核白葡萄产业发展转型，吐鲁番地区楼兰酒业、驼铃酒业等多家酒厂，顺应市场需求，大力发展吐鲁番特色无核白甜葡萄酒产业。但现有的吐鲁番无核白甜葡萄酒果香味比较淡薄，严重影响了无核白甜葡萄酒的品质。筛选适合当地环境条件和葡萄品种的优势天然酵母对酿制特色或独特风格的葡萄酒具有非常重要的意义[1]。近年来，国内外对野生酵母菌资源尤其是酿酒酵母菌的开发利用取得了很大的进展。在葡萄栽培和酿酒历史悠久的欧洲，尤其是名酒产地，目前仍在开发利用当地优越的天然酵母菌群进行发酵，生产和销售了具有地域性风格的葡萄酒[2-3]。我国的各大葡萄酒厂也十分重视在本企业酵母的选育，如烟台张裕酿酒公司选育的7318酵母、7448酵母等。新疆黄宗杭等利用鄯善红葡萄分离筛选葡萄酒酵母，酿制出了具有地方特色的名酒“楼兰古酒”。这些地产酵母为葡萄酒特色和品牌的形成奠定了基础。因此从本地的天然酵母中选育优良葡萄酒酵母是一项十分有价值的工作[4-6]。葡萄酒的风格不仅决定于葡萄品种和酿造工艺，而且与酵母等微生物的发酵作用密切相关。为酿造优质葡萄酒，充分发挥不同品种葡萄的优良品质，所用的酿酒酵母是非常重要的，酵母菌株是葡萄酒品质的重要保证[7-8]。本研究针对无核白甜葡萄酒存在的问题，利用无核白葡萄自然发酵液，筛选出优良的无核白甜葡萄酒产香酵母菌种，提高无核白甜葡萄酒品质。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1酵母菌种来源

无核白葡萄自然发酵液；对照酵母：EC1118，购于上海杰兔有限公司。

1.1.2培养基

(1)产酯培养基：玉米粉60 g，琼脂15～18 g，水1 L，煮沸l h，然后加入2 %乙醇，0.1 %乙酸，调pH5.5，灭菌备用[8]。

(2) PDA培养基：去皮马铃薯300 g，加水煮沸10～20 min，过滤，加入葡萄糖200 g，加水至1 L，灭菌。

1.2实验方法

1.2.1无核白甜葡萄酒产香酵母菌种初筛实验方法

(1)样品的制备：将新鲜无核白葡萄捏碎置于烧杯中，放入恒温培养箱内28℃下培养2～3 d备用。

(2)无核白甜葡萄酒产香酵母的分离：采用产酯培养基，将样品稀释液吸取1 mL于装有9 mL无菌生理盐水中得到10-2稀释菌液，用同样的方法依次稀释为10-3、10-4、10-5、10-6，在稀释过程中进行镜检，当视野内为1～2个或没有酵母菌时，停止稀释。将稀释的菌液吸取0.1 mL加入事先准备好的产香酵母菌培养基中，温度控制在27～28℃，生化培养2～3 d，选择菌落数为100～200的培养皿进行分离纯化[9-10]。

(3)酵母筛选：将分离出的每个菌落接种2个麦芽汁平板上，温度控制在27～28℃，生化培养2～3 d[11]。观察菌落的形状、颜色及气味、表面、质地、边缘、厚度等特征。

1.2.2无核白甜葡萄酒产香酵母菌种复筛实验方法

针对初筛出的菌落进行产酯能力实验、发酵速度实验、产酒精能力实验。通过实验综合对照后，选定产酯量高、发酵速度快、产酒精能力好的无核白甜葡萄酒发酵酵母菌株1株。

1.2.3筛选出的产香酵母菌种的发酵性能参数确定的实验方法

(1)最适pH值测定

调节无核白葡萄汁的pH值为2、3、4、5、6，摇匀后接种W4菌株，接种量3 %，25℃恒温培养，检测并记录生长情况、产气时间、产气量、产酯量及发酵得到的无核白葡萄酒理化指标，确定最适发酵pH值。

(2)最适发酵温度的测定

将无核白葡萄汁按3 %接种量接种菌株W4，分别放置在温度为15℃、20℃、25℃、30℃的温度下发酵，检测并记录生长情况、产气时间、产酯量及发酵得到的葡萄酒理化指标，确定最适发酵温度。

(3)菌株最适初始糖度测定

调节无核白葡萄汁的初始糖度为220 g/L、230 g/L、240 g/L、250 g/L、260 g/L、270 g/L、280 g/L，摇匀后接种W4菌株，接种量3 %，25℃恒温培养，检测并记录生长情况、产气时间、产酯量及发酵得到的葡萄酒理化指标，确定最适初始糖度。

1.3酵母菌株发酵性能及指标检测

菌株产酒精能力测定方法：比色法[12]。

总酯的测定方法：全自动电位滴定法[13]。

菌株发酵力的测定：CO2失重法[14]。

酒精度、总糖、总酸测定：国标法GB 15037—2006。

2　结果与分析

2.1无核白甜葡萄酒产香酵母菌种初筛结果

将分离所得10个菌落接种在麦芽汁平板上，28℃恒温培养24 h后观察。根据平板上菌落的颜色、形状、大小、边缘、表面、透明度、厚度、质地、酯香味等形态特征来初步选择较优酵母菌落，菌落特征见表1。

表1　初筛结果

由表1可以看出，从分离出的10个菌落中选择颜色为乳白色、形状为椭圆或扁圆、大小较均一、边缘整齐、表面凸起、透明度较好、厚度较厚、质地光滑湿润、酯香味浓郁的菌落有5个，即编号为W1、W3、W4、W7、W9。同时将筛选出的这5个菌落作为进一步筛选的研究对象。

2.2无核白甜葡萄酒产香酵母菌种复筛结果

2.2.1不同菌株发酵速率的比较

由图1可以看出，W4菌株发酵速度最快，W1、W3、W7菌株发酵速度相差不大，但是略低于W4菌株，W9菌株发酵速度最慢。W4菌株在发酵第2天，发酵速率直线上升，发酵旺盛期时间在2～8 d，第8天左右开始缓慢发酵，第10天发酵基本结束。W1、W3、W7菌株发酵一般要持续到第11天，且发酵速率不稳定。W9菌株的发酵情况不是很好，发酵较慢。从整体考虑，W4菌株发酵速度最快，发酵状况最好。

图1　不同菌株发酵速率的比较

2.2.2不同菌株产酒精能力的比较

由图2可看出，W4菌株在4～8 d时产酒精能力最强，因为这个时期也是发酵旺盛期，故产生的酒精较快。其次是W3、W1、W7菌株，W9菌株产酒精能力最弱。

图2　不同菌株产酒精能力的比较

2.2.3不同菌株产酯能力的比较

由图3可以看出，W4菌株产酯能力最强，在整个发酵期内产酯量为7.618 g/L，W9菌株产酯能力最弱，在整个发酵期内产酯量为4.523 g/L。

图3　不同菌株产酯能力的比较

2.2.4不同菌株发酵后得到的葡萄酒理化指标的比较

表2　不同菌株发酵后得到的葡萄酒理化指标

由表2可看出，通过对各个菌株的生长情况、产酯量、产气时间以及发酵所得葡萄酒酒精度、总糖、总酸的综合分析，发现W4菌株生长情况较好、产酯量7.638 g/L、12 h之后开始产气、酒精度达到12 %vol、总糖为14.3 g/L、总酸为0.635 g/L。

通过实验综合对照后，选定产酯量高、发酵速度快、产酒精能力较好的W4菌株为无核白甜葡萄酒产香酵母菌株。

2.3筛选菌种发酵性能参数的确定

2.3.1筛选菌株最适pH值测定

表3　不同pH值发酵后得到的葡萄酒理化指标

由表3可看出，无核白葡萄汁pH值为3，W4菌株的生长状况最好，产酯量也最高，为7.167 g/L。当pH值为2时，W4菌株的生长情况较差，主要是因为葡萄汁酸度太高，抑制酵母菌种的生长。当pH值为5～6时，也不利于葡萄汁的生长。故pH值为3是W4菌株的最适pH值。

2.3.2筛选菌株最适初始糖度测定

表4　不同初始糖度发酵后得到的葡萄酒理化指标

由表4可看出，无核白葡萄汁的初始含糖量对W4菌株也具有一定的影响作用。从产酯量来看，葡萄汁的初始含糖量为230 g/L时，产酯最高；从产酒精能力来看，葡萄汁的初始含糖量对其影响没有明显的差异性。故选择初始含糖量230 g/L为W4菌株的最适初始含糖量。

2.3.3筛选菌株最适发酵温度的测定

表5　不同发酵温度发酵得到的葡萄酒理化指标

由表5可看出，发酵温度对W4菌株发酵无核白葡萄汁也具有一定的影响。当发酵温度为20℃时，W4菌株生长状况最好，产酯量也较高。当发酵温度为10℃时，葡萄汁起酵比较困难，发酵速率特别缓慢。当温度为30℃时，发酵过于旺盛，使得酒糟的温度高达37℃，同时产生的挥发酸高。

3　结论

3.1从无核白葡萄自然发酵液中分离出的10个菌落中选择颜色为乳白色、形状为椭圆或扁圆、大小较均一、边缘整齐、表面凸起、透明度较好、厚度较厚、质地光滑湿润、酯香味浓郁的菌落有5个，即编号为：W1、W3、W4、W7、W9。同时将筛选出的这5个菌落作为进一步筛选的研究对象。

3.2通过对各个菌株的生长情况、产酯量、产气时间、酒精度、总糖、总酸的综合分析，发现W4菌株生长情况较好、产酯量7.638 g/L、12 h之后开始产气、酒精度达到12 %vol、总糖为14.3 g/L、总酸为0.635 g/L。

3.3W4菌株的发酵性能参数为：最适pH值为3、最适初始含糖量230 g/L、最适发酵温度为20℃。

参考文献：

[1]张纪忠.微生物分类学[M].上海：复旦大学出版社，1999.

[2] Ibarz M J，Ferreira V F，Hem-dez-Orte P,et a1.Optimization and evaluation of procedure for the gas chromatographic-mass spectrometric analysis of the aromas generated by fast acid hydrolysis of flavor precursors extracted from grapes[J]. Journal of Chromatography A，2006(1116)：217-229.

[3] Regodon JA,Perez F，Miguel C D.Asimple and effective produce for selection of wine yeast mains[J].Food Microbiol，1997：14，247-254.

[4]周秀琴.葡萄酒酵母的选择和育种[J].江苏食品与发酵，1981 (2)：59-63.

[5]王慧，张立强，刘天明，等.产地葡萄酒优良酵母菌株的筛选及鉴定[J].酿酒科技，2007(9)：29-34.

[6]冯克宽，王明谊，曾家豫.酵母菌的分离及鉴定[J].西北师范大学学报：自然科学版，1997，33(2)：56-59.

[7] Boutrou R，Gueguen M. Interests in Geotrichum candidum for cheese-technology[J].International Journal of Food Microbiology，2005，102：1-20.

[8]王允祥.论葡萄酒的风味与营养价值[J].中国酿造, 1998(2)：8-10.

[9]博坦.葡萄酒酿造学原理及应用[M].北京：中国轻工业出版社，2001.

[10]覃宇阳，黄宏慧.野生山葡萄酒酵母筛选及应用[J].广西轻工业，1999(1)：45-46.

[11] Versini G, Rapp A, Volkmann C，et a1.Flavour components of clones from different grape varieties[J].Vitis,1990：513-524.

[12]魏冬梅，张艳芳，张于林.利用比色法测定葡萄酒的洒精度[J].食品工业，2001(4)：45-46.

[13]刘群，扬福洪，尚维，等.用电位滴定法测“产酯酵母”的总酯[J].酿酒，1996(5)：27-28.

[14]张建军.葡萄汁酒精发酵过程中由酵母产生的氨基酸己酯[J].葡萄栽培与酿酒，1994(3)：43-45.

[15]雷安亮，钟其顶，刘长江，等.葡萄酒香气分析方法研究现状及应用展望[J].酿酒，2008(11)：24-27.

Screening of A Yeast Strain with Aroma-producing Capability for Seedless White Grape Wine & Study of Its Fermenting Performance

LEI Jing, WU Bin, GUO Feng, HAN Chen, CHEN Ya and AYijiamali
(Turpan Institute of Agricultural Sciences, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Turpan, Xinjiang 838000, China)

Abstract:Wine aroma is an important sensory index in the evaluation of wine quality. Aromatic substances are also the important components of both grape and grape wine. Seedless white grape belongs to white grape and its intrinsic aroma is weak. Accordingly, the use of yeast strains with good aroma-producing capabilities in wine-making by seedless white grape is a reliable and safe approach. In the experiments, a yeast strain with good aroma-producing capabilities named W4 was isolated from naturally fermented liquid of seedless white grape. Meanwhile, the fermenting performance of W4 was investigated and the optimum technical parameters were summed up as follows: pH value=3, fermenting temperature at 20℃, and the initial sugar content was 230 g/L. The total esters content in the produced wine by W4 reached up to 7.335 g/L. The screened W4 could increase total esters content in grape wine effectively and evidently.

Key words:seedless white grape wine; yeast with aroma-producing capability; screening; fermentation; performance

通讯作者：郭峰（1964-），男，硕士研究生，研究方向为农产品加工。

作者简介：雷静（1982-），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与储藏，E-mail：leijing200288@163.com。

收稿日期：2015-11-17

基金项目：新疆农业科学院青年基金项目，项目编号（xjnkq-2013008）；自治区青年自然科学基金项目，项目编号（2014211B032）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015439

中图分类号：TS262.6；TS261.1；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）03-0045-04

优先数字出版时间：2016-01-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160122.0939.002.html。