透镜诱导豚鼠近视眼超微结构的观察

张　新，王超英(.河北医科大学第一医院眼科，河北 石家庄 05003；.中国人民解放军白求恩国际和平医院眼科，河北 石家庄 05008)



·论著·

透镜诱导豚鼠近视眼超微结构的观察

张新1，王超英2(1.河北医科大学第一医院眼科，河北 石家庄 050031；2.中国人民解放军白求恩国际和平医院眼科，河北 石家庄 050082)

[摘要]目的观察豚鼠实验性近视眼组织超微结构的改变，探索近视发病机制。方法选用出生后2周龄的豚鼠39只，随机分为A、B、C 3组，每组13只，选取任意一眼戴-10.00 DS凹透镜,分别于10、30、50 d后去除镜片，验光，测眼球长度，摘除眼球行光镜电镜检查。结果诱导后实验眼和对照眼均出现近视，眼轴增长，与诱导前比较差异有统计学意义(P<0.05)；且随时间延长，眼屈光度、眼轴变化越严重(P<0.05)。实验眼眼屈光度低于对照眼，眼轴长于对照眼(P<0.05)。实验眼3组间巩膜厚度比较差异有统计学意义(P<0.05)，C组巩膜厚度较A组薄(P<0.05)。C组实验眼巩膜厚度较对照眼薄(P<0.05)。A组巩膜胶原纤维排列稍紊乱。B组巩膜胶原纤维排列稍紊乱、粗细不均、间隙变大。C组巩膜胶原纤维排列紊乱、粗细不均、间隙变大，胶原纤维板层结构不清，局部纤维母细胞增生。C组视网膜外核层细胞核变小、变圆，排列不均，视细胞层外节、内节排列紊乱。结论豚鼠可作为研究实验性近视的一种经济有效的哺乳类模型动物。实验性近视眼的巩膜、视网膜均发生了一系列的退行性改变。

[关键词]近视；透镜；超微结构；豚鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.008

近视的发病机制迄今尚未明了。近视眼动物模型为研究近视眼的发生原因和近视化过程提供了极有价值的途径。本实验用凹透镜诱导的方法制成豚鼠的近视模型，检测其屈光状态、眼轴长度，并观测其超微结构的改变，旨在为探讨近视进展的病理因素及进一步防治打下基础。报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物及分组2周龄已脱离母乳喂养的小豚鼠39只，无眼部疾患，雌雄不限，由河北省实验动物中心提供，随机分为A(10 d)、B(30 d)、C(50 d)3组，每组13只。每只动物随机选择一眼为实验眼，另一眼为自身对照。幼豚鼠于室内标准化喂养，白天用自然光照射，每日光照与黑暗的周期比例为14∶10，室温控制在20 ℃。

1.2凹透镜片自行设计的PMMA镜片，部分参数如下：镜片直径13.5 mm，光学直径10.5 mm，基弧为9.61，屈光度均为-10.00 DS[1]。

1.3方法将豚鼠标记编号，双眼结膜囊滴1%托吡卡胺滴眼液3次，每次间隔10 min，带状光检影验光；股部肌内注射盐酸氯胺酮(50 mg/kg)致全身麻醉，用A超测量双眼球眼轴长度。测量以手动模式连续测量10次，计算平均值，精确到0.01 mm。随机选择一眼为实验眼，另一眼为自身对照，在全身麻醉状态下，无菌操作，将镜片固定于豚鼠眼前(镜片缝合至内、外眦皮肤)。实验期间注意随时清洁镜片，尽量减少镜片不洁造成的形觉剥夺效应。将上述豚鼠于室内标准化喂养，10、30、50 d后摘除实验镜片，按前述方法再次行双眼睫状肌麻痹检影验光和A超测量眼轴[2]。处死豚鼠，每组取2只豚鼠眼球放入4%戊二醛溶液中固定。其余眼球行光镜观察。

1.4光镜观察标本置于眼球固定液中48 h后，经各级酒精脱水，石蜡浸透包埋切片，HE染色，光镜观察眼球壁的各层组织结构及测量巩膜厚度。

1.5电镜观察取眼球后极部眼球壁切成>1 mm大小组织块4%戊二醛溶液中固定，1%锇酸后固定，各级酒精及丙酮脱水，浸透包埋，固化，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察。

1.6盲法处理检影验光及所有测量均由另一位专业人员操作，操作人员不知被检眼是实验眼还是对照眼。

1.7统计学方法应用SPSS 19.0统计学软件分析数据。计量资料比较分别采用t检验、配对t检验、F检验和q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1豚鼠实验性近视的诱导结果诱导前3组实验眼和对照眼屈光度、眼轴长度比较差异均无统计学意义(P>0.05)；诱导后实验眼和对照眼均出现近视，眼轴增长，与诱导前比较差异有统计学意义(P<0.05)；且随时间延长，眼屈光度、眼轴变化越严重，3组间差异均有统计学意义(P<0.05)。实验眼屈光度低于对照眼，眼轴长于对照眼，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1豚鼠凹透镜诱导前后双眼屈光度及眼轴长度变化

Table 1Refraction and axial of guinea pig eyes before

and after monocularly Lens-inducing

组别实验眼屈光度(D)诱导前诱导后对照眼屈光度(D)诱导前诱导后A组+3.54±1.11-1.94±0.81*☆+3.96±1.69+2.87±0.83*B组+3.33±0.87-3.78±1.04*#☆+3.17±0.98+1.58±0.82*#C组+2.58±0.73-6.38±0.59*#△☆+2.90±0.78+1.27±1.44*#F3.17593.0513.19811.495P0.0620.0000.0610.001组别实验眼眼轴长度(mm)诱导前诱导后对照眼眼轴长度(mm)诱导前诱导后A组7.71±0.138.24±0.17*☆7.72±0.177.98±0.30*B组7.54±0.358.41±0.38*☆7.58±0.268.02±0.21*C组7.47±0.239.49±0.81*#△☆7.44±0.298.45±0.29*#△F3.03521.6133.00412.136P0.0700.0000.0710.001

*P<0.05与诱导前比较(配对t检验)#P<0.05与A组比较△P<0.05与B组比较(q检验)☆P<0.05与对照眼比较(t检验)

2.2巩膜厚度比较对照眼3组间巩膜厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验眼3组间巩膜厚度比较差异有统计学意义(P<0.05)，C组巩膜厚度较A组薄，差异有统计学意义(P<0.05)。A组和B组实验眼与对照眼巩膜厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)，C组实验眼巩膜厚度较对照眼薄，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表23组实验眼与对照眼巩膜厚度比较

Table 2Comparison of thickness of scleral in induced

eye and control eye three groups

组别巩膜厚度实验眼对照眼tPA0.35±0.030.35±0.020.0001.000B0.34±0.030.36±0.031.7000.102C0.32±0.03*0.37±0.025.0000.000F3.3702.294P0.0460.115

*P<0.05与A组比较(q检验)

2.3光镜观察结果巩膜：A组 (10 d)除巩膜胶原纤维排列稍紊乱外，未见其他表现(图1)；B组(30 d)巩膜胶原纤维排列稍紊乱、粗细不均、间隙变大(图2)；C组(50 d)巩膜变化较明显，可见巩膜胶原纤维排列紊乱、粗细不均、间隙变大，可见胶原纤维板层结构不清，局部可见纤维母细胞增生(图3)。脉络膜:未发现明显变化。视网膜： A组(10 d)、B组(30 d)均未见明显变化；C组(50 d)视网膜外核层细胞核变小、变圆，排列不均，视细胞层外节、内节排列紊乱(图4)。

2.4电镜观察结果巩膜：A组(10 d)巩膜胶原纤维排列稍紊乱(图5)；B组(30 d)胶原纤维排列中度紊乱，粗细不均(图6)；C组(50 d) 胶原纤维排列重度紊乱，粗细不均，间隙变大。粗面内质网扩张(图7)。视网膜：与对照眼比较, A组(10 d)组视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)绒毛样突起减少，排列紊乱(图8)；B组(30 d)视网膜RPE绒毛样突起稀疏变短，排列紊乱，视细胞外节盘膜间隙大小不一(图9)；C组(50 d)视网膜RPE长突起消失融合，部分盘膜连续性中断、破坏(图10)。

图1 A组豚鼠视网膜、脉络膜、巩膜(HE×200)

Figure1 Retina,choroidsandscleraofguieapigmyopiceyeingroupA(HE×200)

图2 B组豚鼠视网膜、脉络膜、巩膜(HE×200)

Figure2 Retina,choroidsandscleraofguieapigmyopiceyeingroupB(HE×200)

图3 C组豚鼠视网膜、脉络膜、巩膜(HE×200)

Figure 3Retina, choroids and sclera of guiea pig myopic eye in group C (HE ×200)

图4C组豚鼠视网膜(HE ×200)

Figure 4Retina of guiea pig myopic eye in group C (HE ×400)

图5A组豚鼠巩膜胶原纤维电镜下结果(×20 000)

Figure 5Collagen fibers of guinea pig myopic eye in group A TEM(×20 000)

图6B组豚鼠巩膜胶原纤维电镜下结果(×20 000)

Figure 6Collagen fibers of guinea pig myopic eye in group B TEM(×20 000)

图7C组豚鼠巩膜胶原纤维电镜下结果(×20 000)

Figure 7Collagen fibers of guinea pig myopic eye in group C TEM(×20 000)

图8A组豚鼠视网膜色素上皮微绒毛和盘膜电镜结果(×20 000)

Figure 8Brush-like of RPE cell and membrane disk of myopic eye in group A TEM(×20 000)

图9B组豚鼠视网膜色素上皮微绒毛和盘膜电镜结果(×20 000)

Figure 9Brush-like of RPE cell and membrane disk of myopic eye in group B TEM(×20 000)

图10C组豚鼠视网膜色素上皮微绒毛和盘膜电镜结果(×20 000)

Figure 10Brush-like of RPE cell and membrane disk of myopic eye in group C TEM(×20 000)

3讨论

近视眼动物模型为研究近视眼的发生原因和近视化过程提供了极有价值的途径。有学者认为，形觉剥夺性近视和离焦性近视的病理变化并没有明显不同[3]，但大多数学者认为离焦诱导性近视更接近人类青少年近视的发生，主要是光感受器接受离焦光线的信号刺激后，启动局部视网膜生长调节通路，通过视网膜、脉络膜级联放大效应最终引起靶组织巩膜的改变和眼轴的延长，近视得以发生发展[4]。本研究以幼豚鼠(2周龄)为实验对象，采用凹透镜诱导的方法，分别在10、30、50 d内均诱导出了近视，成功建立了实验性近视的动物模型。说明此期豚鼠眼对透镜去焦是敏感的。诱导后对照眼亦出现远视度数降低、眼轴的延长，与诱导前比较差异有统计学意义(P<0.05)； 3组间差异均有统计学意义(P<0.05)。幼年豚鼠的眼轴均处于远视状态，眼轴的发育是一个由远视状态向近视发展的过程，在没有外界因素的干扰下，眼轴也会随年龄增长而增长，与人眼的发育状态相一致。豚鼠性情温顺，具有生长发育期较短、方便饲养、易于检查等特点。豚鼠眼解剖结构、生理功能与人眼相似，且史剑波等[5]通过计算机图像分析系统对正常豚鼠视网膜结构进行的定量分析表明豚鼠具有较好的视力。因此，豚鼠可作为透镜诱导性近视研究的一种经济有效的模型哺乳动物。

3.1巩膜组织学改变及超微结构改变实验性近视眼的突出表现就是眼轴延长，本研究用凹透镜诱导10、30、50 d后，实验眼出现眼轴增长，与诱导前比较差异有统计学意义(P<0.05)；且随时间延长，眼轴越长，3组间差异均有统计学意义(P<0.05)。近视性眼底病变与眼轴过度延长关系密切， 已被众多学者所证实[6]。这种眼轴的延长是巩膜重新塑形的结果，伴有巩膜的病理学改变。关国华等[7]证实，近视眼巩膜硬度 E 值明显下降， 巩膜的弹性模量、 最大载荷及最大应力均明显下降， 最大应变力增高。有研究显示，在哺乳动物实验性近视眼中， 巩膜成纤维细胞生长抑制， 有丝分裂活性降低，胶原纤维合成代谢减少、 分解代谢增加， 这些改变最终引起胶原纤维直径变小， 巩膜进行性变薄， 导致眼轴延长及近视形成[8]。豚鼠等哺乳动物的巩膜主要由胶原纤维、成纤维细胞和细胞外基质构成。豚鼠形成近视眼时，后极部巩膜胶原优先受影响，由于后极部巩膜胶原减少，减弱了巩膜的抵抗力，使眼轴易于延展，从而发生近视。透镜诱导可以通过局部视网膜机制来调控邻近巩膜生长，视觉信号通过某些途径转变为调控巩膜重塑的信号，巩膜重塑不会导致巩膜组织的净增长，但改变了巩膜组织的机械特性，降低了巩膜对正常眼压的抵抗力，引起眼球扩张和近视屈光度增加，从而导致眼轴延长， 产生轴性近视[9]。本研究光电镜发现豚鼠实验眼的巩膜胶原纤维排列紊乱、粗细不均，纤维间隙变大，可见胶原纤维走向不一、板层结构不清，局部可见纤维母细胞增生，这种变化以C组最为明显。巩膜的病理改变与生物力学特性改变相关。本研究通过生物测量巩膜厚度发现C组实验眼巩膜厚度较对照眼薄(P<0.05)；实验眼3组间巩膜厚度比较差异有统计学意义(P<0.05)，C组巩膜厚度较A组薄，差异有统计学意义(P<0.05)；C组实验眼巩膜纤维细胞内出现了粗面内质网的扩张。粗面内质网扩张是细胞变性基本特点之一。随着诱导时间的延长，巩膜变薄，胶原纤维断裂，纤维细胞出现变性、水肿，出现纤维母细胞活化、分裂、增生，成为纤维细胞以修复局部变性的胶原纤维。陈博宇等[2]研究表明，巩膜成纤维细胞在转化生长因子β2的影响下，表现为细胞核外形不规则，胞质水肿，胞浆内线粒体较多而小，部分线粒体水肿，粗面内质网扩张，内质网及核糖体等细胞器均减少， 细胞界膜不清，部分界膜消失。丁雯芝等[10]研究发现，豚鼠形觉剥夺超高度近视眼的视网膜、脉络膜和巩膜厚度较对照组明显变薄，结构也发生紊乱。形觉剥夺超高度近视眼巩膜结构疏松，胶原纤维部分分离断裂，细胞外基质增多，脉络膜血管层松散稀疏不规则，毛细血管密度减低，眼轴增长和近视产生与巩膜的主动重塑和被动延伸以及脉络膜萎缩血流量减少密切相关。近视眼巩膜的硬度下降，应变力增大，巩膜在眼内压的作用下被动扩张，从而引起眼轴不断延长[11]。实验性近视眼的巩膜弹性差，易变性，具有较低的承载能力[12]。总之，胶原纤维的退行性改变减弱了其抗牵拉的特性，其最终的结果是导致不可逆的眼轴的延长。

3.2视网膜的组织学改变及超微结构正常视网膜色素上皮顶端的细长突起似微绒毛，它们以薄片状套进视锥、视杆细胞外段的远端。眼轴的延长还可能导致脉络膜的血管拉伸、退行性改变、血-视网膜屏障、视网膜-脉络膜屏障功能破坏，从而导致脉络膜、 视网膜的变性和萎缩，在光镜下可见后极部视网膜厚度明显变薄， 这可能是近视眼眼底病变的形成及其并发症产生的病理基础[13]。本研究通过光电镜观察发现，对照眼视网膜RPE伸出长绒毛样突起，整齐密集，这些突起在视细胞外段伸展，并部分包裹着外段；而实验眼视网膜外核层细胞核变小、变圆，排列不均，视网膜RPE向内伸出的微绒毛减少、断裂，甚至融合消失，视细胞层排列紊乱，膜盘间隙大小不一，部分盘膜连续性中断、破坏。正常视细胞的代谢是靠内、外节连接处的盘膜不断生成和视细胞顶端旧的盘膜不断脱落成碎片，并被视网膜RPE不断吞噬完成的。配戴负镜引起视网膜上模糊成像，使视网膜细胞活动异常，影响视细胞外节盘膜的脱落和(或)RPE吞噬功能，从而改变了视细胞的代谢水平，引起视网膜的一系列病理改变，文丹等[14]研究发现，视网膜盘膜有不同程度的水肿和脱落，线粒体肿胀、变形及空泡样改变，染色体边聚等细胞凋亡特征，其认为异常光信号是近视形成的外界因素，它投射至视网膜后可能通过光传导信使环鸟苷酸传递视觉信号,并通过一定的视网膜传导通路传至巩膜效应器以调控眼球生长，参与近视形成。随着眼轴长度增加，视网膜厚度变薄[15]。在近视诱导过程中，视网膜出现的一系列病理改变，影响了视网膜的正常功能活动，最终作用于巩膜，引起眼轴延长。

眼球的生长发育是一个错综复杂的过程，可能受多种因素的调控，视网膜视觉信息如何转变为调节巩膜生长信号，是近视眼研究的关键问题，还需进一步探讨。

[参考文献]

[1]陈博宇，王超英，安慧琴，等.豚鼠早期实验性近视眼 RPE细胞的培养及生长周期的变化[J].眼科新进展，2011,31(2)：108-112.

[2]陈博宇,王超英,马景学，等.TGF-β2对豚鼠实验性近视眼后极部巩膜成纤维细胞的增殖和超微结构的影响[J].临床误诊误治,2011,24(9):1-4.

[3]Xiao H，Fan ZY，Tian XD，et al. Comparison of form-deprived myopia and lens-induced myopia in guinea pigs[J]. Int J Ophthalmol,2014,7(2):245-250.

[4]赵宏伟，梁静南，罗玲,等.离焦诱导豚鼠近视眼视网膜超微结构及凋亡研究[J]. 国际眼科杂志，2014,14(11)：1946-1949.

[5]史剑波，徐锦堂，夏潮涌，等.豚鼠视网膜正常结构的定量研究[J]. 眼科研究，1999,17(2):98-100.

[6]屠颖，魏文斌，周丹，等.病理性近视眼的黄斑形态和功能变化特征[J].中华眼科杂志，2008，44(9):794-799.

[7]关国华，黄仲委，余杨桂,等.病理性近视之巩膜硬度及其在发病因素中之作用[J].广州中医药大学学报,1997,14(1):29-32.

[8]McBrien NA, Lawlor P, Gentle A. Scleral remodeling during the development of and recovery from axial myopia in the tree shrew[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(12): 3713-3719.

[9]周凌霄，王理论，张林.形觉剥夺性近视豚鼠视网膜形学观察及TGF-β2表达[J].国际眼科杂志,2014,14 (11):1950-1952.

[10]丁雯芝，张婷，贾丽丽,等.豚鼠形觉剥夺超高度近视模型的形态学研究[J].临床眼科杂志，2014,22(4):359-363.

[11]李从心，张阳阳，李韵秋,等.视网膜黄斑区神经节细胞复合体厚度与眼轴长度的相关性研究[J].临床眼科杂志，2015,23(2)：97-101.

[12]张新，王超英，李涛,等.实验性近视眼巩膜病理学与生物力学特性的改变[J].眼科新进展，2012，32(11):1017-1020.

[13]吕鲁萍，李兵.高度近视眼黄斑区视网膜厚度的相关因素分析[J].国际眼科杂志,2014,14(5):863-865.

[14]文丹，刘双珍，毛俊峰,等.近视豚鼠视网膜超微结构改变及环磷酸鸟苷的表达[J].中南大学学报:医学版，2011,36(3)：249-253.

[15]Ooto S，Hangai M，Yoshimura N. Effects of sex and age on the normal retinal and choroidal structures on optical coherence tomography[J]. Curr Eye Res，2015，40(2):213-225.

(本文编辑：赵丽洁)

Observation on ultrastructure of lens-induced myopia in guinea pig

ZHANG Xin1， WANG Chao-ying2

(1. Department of Ophthalmology， the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031, China； 2.Department of Ophthalmology， the Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, China)

[Abstract]ObjectiveTo study the ultrastructure changes of myopia induced by lens-induced method and to explore its pathological mechanism. MethodsThirty-nine guinea pigs with two weeks old were randomly divided into three groups:group A, group B and group C, with thirteen rats in each group. A eye was randomly selected to wear -10. 00 DS concave lens, which was removed after culturing for 10 days, 30 days and 50 days in group A, group B and group C, respectively .Two-week-old guinea pigs were lens-induced monocularly. At day 10，day 30 and day 50, the lens were removed respectively. After measurement of referaction and axial length,eyeballs were removed and the eyes were observed by light and electronmicroscope. ResultsAfter the experiment, the exprerimental eyes and the control eyes were induced myopia, the growth of the eye axis, the difference was statistically significant(P<0.05). And with the time prolonged, the more severe the eyes, the more serious the axial length(P<0.05) . The refractive degree of the experimental eye was lower than that of the control, and the axial length was longer than that of the control eye(P<0.05). There were significant differences among the 3 groups in the scleral thickness(P<0.05). The thickness of group C was thinner than that of group A(P<0.05). Compared with the control eyes, the scleral thickness in group C was thinner than that in control group(P<0.05). The collagen fibers in the group A were slightly disordered. The arrangement of collagen fibers in group B were slightly disordered, thickness was uneven, and gaps became larger. In group C, the disorder of collagen fibers and uneven thickness of the collagen fibers were increased, and the structure of collagen fibers was not clear. In group C, the outer nuclear layer of the retina became smaller and round, and arrangement was disordered. ConclusionThe guinea pig can be used as an effective and economical manmmal model in experimental myopia study. The degenerations were occurred in sclera and retina in the experimental models.

[Key words]myopia； lenses； ultrastructure； guinea pigs

[中图分类号]R778.11

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)03-0275-05

[作者简介]张新(1978-)，女，河北衡水人，河北医科大学第一医院主治医师,医学硕士，从事眼科疾病诊治研究。

[收稿日期]2015-09-08；[修回日期]2015-10-13