脂肪酶水解麦糟中脂肪的反应动力学研究

许彬，李慧星，肖连冬，郝同飞（南阳理工学院生物与化学工程学院，河南南阳473004）



脂肪酶水解麦糟中脂肪的反应动力学研究

许彬，李慧星，肖连冬，郝同飞
（南阳理工学院生物与化学工程学院，河南南阳473004）

摘要：脱脂是制备麦糟膳食纤维的重要工序。实验利用脂肪酶水解麦糟中脂肪，采用单因素实验和响应曲面法考察并优化影响反应速率的因素。在优化的条件下，依据中间复合物学说，建立酶促动力学方程。结果表明：在pH 7.0，温度40℃，加酶量0.32 g，C(Mg)2+为0.108 mol/L条件下，反应速率达0.67 mg/mL·h，酶促动力学方程为。结果可为应用脂肪酶水解麦糟中脂肪的生产强化和工程设计提供技术参考。

关键词：麦糟；脂肪酶；动力学；膳食纤维

麦糟是啤酒工业的主要副产物，富含非淀粉多糖[1-3]。利用它来生产“第七大营养素”膳食纤维，具有良好的环境和经济效益。目前，酶碱法是制备麦糟膳食纤维的主要方法，采用脱脂、酶解、碱解工序脱除脂肪，淀粉和蛋白等[4-9]。前期研究中已指出利用脂肪酶脱脂具有可行性，取得了良好效果，且相比较于传统的有机溶剂法脱脂具有反应条件温和、无污染、无有机溶剂残留等优势[10]。

反应动力学是研究催化反应速率的科学，考察各因素对反应速率的影响，建立可靠而适用的动力学方程，以期用数学原理和质量作用定律来解释反应的进程。反应动力学的研究对于强化生产，工程设计和催化性能改进具有重要的指导意义。酶催化反应动力学的研究多采用Michealis和Menten提出的中间复合物学说，该学说认为酶催化反应包括两步，酶（E）与底物（S）首先结合形成中间复合物（ES），然后该复合物分解成产物（P）。此外，在中间复合物学说基础上建立的米氏方程已被广泛应用于描述各种酶促反应动力学[11-13]。

试验研究脂肪酶水解麦糟中脂肪的反应动力学，采用单因素试验和响应曲面法考察影响反应速率的因素，优化条件。根据Michealis-Menten提出的学说，建立描述酶促动力学的米氏方程，并利用Wilkinson统计法[14]精确求解动力学参数米氏常数Km和最大反应速率Vm，以期为实现工程上应用脂肪酶制备麦糟膳食纤维提供技术参考。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

麦糟（膳食纤维60.8 %，粗蛋白21.8 %，粗脂肪7.8 %，淀粉3.0 %，灰分3.0 %）：南阳天冠啤酒有限公司；脂肪酶（pH6.5～10.5，温度15℃～40℃，酶活力10 000 u/g）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；乙醚、盐酸、氢氧化钠、硫酸钾、硫酸亚铁、氯化钙、硫酸铜等试剂均为分析纯。

TDL-4013台式离心机：上海安亭科学仪器厂；AR1140/C电子天平：上海奥豪斯公司；HHS21-4电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；FW-100高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1脂肪酶水解的单因素试验

酶促反应体系是在250 mL三角瓶中进行，加入麦糟5 g，添加一定量脂肪酶和金属离子，反应体系体积为100 mL，在一定的温度、pH下振荡反应0.5 h后取出，迅速在沸水浴中加热10 min钝化酶，使反应终止，离心后干燥至恒重。反应速率定义为式1：

反应速率/（mg/mL·h）＝

以反应速率为指标，通过单因素试验考察温度、加酶量、金属离子、pH 4个因素的影响，每个试验重复3次，结果取平均值。

1.2.2响应面试验

在单因素试验的基础上，设计Box-Behnken试验方案[15]进一步研究温度、加酶量和CMg2+对反应速率的影响，考察因素的交互作用及显著性，优化条件。设变量X1、X2、X3分别代表温度、加酶量和CMg2+，因素水平及编码见表1。

表1试验因素水平及编码Table 1 Code and level of factors chosen for the trials

1.2.3反应动力学研究

分别取4、6、8、10、12、14、16 g麦糟作为底物，在优化得到的条件下，考察不同底物浓度对反应速率的影响，依据Michealis-Menten提出的中间复合物学说，建立酶促动力学方程，并通过Wilkinson统计法求解酶促反应的2个重要动力学参数，米氏常数Km（mg/mL）和最大反应速率Vm（mg/mL·h）。

1.2.4脂肪的测定参考文献[10]。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1温度对反应速率的影响

图1为在加酶量0.25 g，pH6.5，温度对反应速率的影响。

图1温度对反应速率的影响Fig.1 Effect of temperature on reaction velocity

反应速率曲线为钟罩形曲线，实验现象与酶促反应规律吻合，即温度对反应速率影响是温度加速酶催化速率和温度加速酶变性失活两个方面的综合。在25℃～40℃范围内，温度未超过脂肪酶耐受的温度，酶活性随着温度的升高而升高，反应速率不断增加。当温度超过40℃时，高温使酶变性失活，随着温度的升高，酶的活性下降，反应速率显著降低。

2.1.2加酶量对反应速率的影响

当温度为35℃，pH6.5时，加酶量对反应速率的影响见图2。

图2加酶量对反应速率的影响Fig.2 Effect of additional lipase amount on reaction velocity

根据中间复合物学说，酶促反应在底物过量情况下，加酶量的增加，可以提供更多的酶活性位点催化底物生成产物，理论上，反应速率应与加酶量呈正比例关系。由图2可以看出，反应速率随着加酶量的增加而提高，但当加酶量为0.30 g时，继续提高加酶量，酶与底物的接触位点逐渐趋于饱和，反应速率的增加幅度较小。

2.1.3金属离子对反应速率的影响

温度35℃，pH6.5，加酶量0.25 g条件下，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+和Cu2+5种金属离子对反应速率的影响见图3。

图3金属离子对反应速率的影响Fig.3 Effect of metal ion on reaction velocity

金属离子可以是酶的激活剂，也可以是酶的抑制剂，大多情况下，金属离子是酶的激活剂，即能提高酶活性，加速酶促反应的进行。此外，不同金属离子对酶的激活作用具有一定选择性。由图3可知，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+4种金属离子是脂肪酶的激活剂，并且随着金属离子浓度的增加，反应速率不断提高，其中Mg2+的激活作用较明显，而Ca2+、Fe2+和Zn2+3种金属离子的激活作用不明显。添加Cu2+，酶活性被抑制，且提高Cu2+浓度，反应速率降低，可知Cu2+是脂肪酶的抑制剂。

2.1.4 pH对反应速率的影响

在温度35℃，加酶量0.25 g的条件下，pH对反应速率的影响见图4。

图4 pH对反应速率的影响Fig.4 Effect of pH on reaction velocity

随着pH的变化，酶、底物可处在不同的解离状态，会影响酶和底物的结合，从而影响酶促反应速率。由图4可以看出，pH和反应速率的变化曲线为钟罩形，在pH6.0～9.0范围内，反应速率随着pH的增加而提高，但当pH7.0时，继续提高pH，反应速率提高幅度较小。当pH10.0时，反应速率突然下降，可能是超出了酶生理pH范围，改变了酶活性构象，使酶活性降低。考虑到实际应用生产过程，中性pH对操作和设备的要求低，因此在试验选择的水平范围内，选择pH 7.0。2.2响应曲面法优化条件

在单因素试验的基础上，采用响应曲面法的Box-Behnken试验方案优化条件，试验结果见表3，因素的方差分析见表4。

表3试验设计方案及结果Table 3 Experimental designs and results

表4因素方差分析Table 4 Analysis of mean square deviation of factors

由表4可知，FX1×X1、FX2×X2>F0.01（1，5）=16.25，表明温度二次项和加酶量二次项的影响高度显著；F0.01（1，5）=16.25> FX2、FX3、FX3×X3>F0.05（1，5）=6.61，表明加酶量、CMg2+及CMg2+二次项的影响显著。

通过SAS8.0软件优化得到的条件为：X1=0、X2=0.2、X3=0.4，即温度40℃，加酶量0.32 g，CMg2+为0.108 mol/L，该条件下，模型预测反应速率0.68 mg/mL·h。在该条件下，重复试验3组，结果见表5，反应速率为0.67 mg/mL·h，变异系数1.59 %，结果稳定，可靠。

表5重复试验结果Table 5 Results of repeated experiment

2.3酶促反应动力学

pH7.0，温度40℃，加酶量0.32 g，CMg2+为0.108 mol/L条件下，底物浓度对反应速率的影响见图5。

图5底物浓度对反应速率的影响Fig.5 Effect of substance concentration on reaction velocity

随着底物浓度的增加，反应速率不断提高，在底物浓度较低时，反应速率随底物浓度增加而急剧增加。随着底物浓度的增加，反应速率的提高幅度逐渐减小，反应速率趋于恒定。试验根据Michealis-Menten提出的中间复合物学说，酶（E）与底物（S）首先结合成二元中间复合物（ES），ES分解为产物（P）和释放酶，其反应方程为式2：

用米氏方程（式3）拟合图5中试验数据，建立酶促动力学方程[16]。

式中：CS为底物浓度，（mg/mL）；Vm为最大反应速率，（mg/mL·h）；Km为米氏常数，（mg/mL）。

米氏方程中两个重要动力学参数米氏常数Km和最大反应速率Vm的求解常用Lineweaver-Burk法[d]，但要求底物浓度在0.33 Km～2.0 Km范围内才比较准确，否则求解的误差较大。Wilkinson统计法是包括非线性求估算解和泰勒展开式求精校解，可以克服底物浓度过大或过小造成的计算误差，其求解结果较为可靠[11]。采用Wilkinson统计法求解Km和Vm，计算过程如表6和表7。

表6 Wilkinson法求估算解Table 6 Calculate the provisional value by Wilkinson method

表7 Wilkinson法求精校解Table 7 Fine adjustment of value by Wilkinson method

式4中：Km0是米氏常数的估算解；式5中Vm0是最大反应速率的估算解；式6、式7中b1和b2为计算过程中的修正常数。式8和式9为米氏常数Km和最大反应速率Vm的精确解。建立的酶促动力学方程如式（10）所示：

3　结论

1）脂肪酶水解麦糟中脂肪的过程中，温度二次项和加酶量二次项对反应速率的影响高度显著，而加酶量、CMg2+及CMg2+二次项的影响显著。在选择的水平范围内，优化得到的条件是：pH 7.0，温度40℃，加酶量0.32 g，CMg2+为0.108 mol/L，该条件下反应速率达0.67 mg/mL·h。

2）根据Michealis-Menten提出的中间复合物学说，采用Wilkinson统计法精确求解反应动力学参数，在优化的条件下，建立了脂肪酶水解麦糟脂肪的酶促动

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Reaction Dynamics of Liqid Hydrolysis from Brewer's Spent Grains with Lipase

XU Bin，LI Hui-xing，XIAO Lian-dong，HAO Tong-fei
（College of Biology and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，Henan，China）

Abstract：Degrease is an important process in dietary fiber preparation from brewer's grain. Dynamics of lipid hydrolysis from brewer's grains with lipase was studied. The effects of pH，temperature，time and additional amount of enzyme were investigated by single-factor experiments and response surface methodology with Box-Behnken design. A model of lipid hydrolysis dynamics was built with Michaelis-Menten equation. The optimized conditions were pH 7.0，temperature 40℃，additional amount of enzyme 0.32 g and concentration of magnesium 0.108 mol/L. Under these conditions，maximum reaction velocity achieved 0.67 mg/mL·h. The model of lipid hydrolysis dynamics was. The results would provide references for preparation of brewer's grain dietary fiber.

Key words：brewer's grain；lipase；dynamics；dietary fiber

收稿日期：2014-06-15

作者简介：许彬（1980—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：农产品加工贮藏。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.048