康复新在巨噬细胞炎症反应中的抗炎作用及其机制

汤雁利，张玉皓，李罡，李启艳

(1云南省第一人民医院，昆明650032；2昆明理工大学附属医院；3昆明医科大学附属口腔医院)



康复新在巨噬细胞炎症反应中的抗炎作用及其机制

汤雁利1,2，张玉皓1,2，李罡3，李启艳1,2

(1云南省第一人民医院，昆明650032；2昆明理工大学附属医院；3昆明医科大学附属口腔医院)

摘要：目的观察康复新在巨噬细胞炎症反应中的抗炎作用，并探讨其可能的作用机制。方法 将培养好的小鼠巨噬细胞RAW264.7随机分为6组：A组(加入DMSO)、B组(加入DMSO)、C组(加入炎症抑制药物BAY11-7082)、D组(加入1%康复新)、E组(加入0.1%康复新)、F组(加入0.01%康复新)，药物干预后继续培养1 h，A组加DMEM培养液，其余各组加入LPS(100 μg/L)诱导细胞产生炎症反应。造模后4、8 h收集细胞，用qRT-PCR法检测细胞中白细胞介素(IL)6、肿瘤坏死因子(TNF)α、前列腺素内过氧化物合酶(PTGS)2的mRNA表达。结果造模后4、8 h，与A组比较，B组IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表达水平均升高(P均<0.05)；与B组比较，C组IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表达均降低(P均<0.05)。D组在收集细胞时即观察到细胞全部死亡。与B组比较，E、F组IL-6、TNF-α的mRNA表达升高，PTGS2的mRNA表达降低(P均<0.05)；与C组比较，E、F组IL-6、TNF-α的mRNA表达差异有统计学意义(P均<0.05)，而PTGS2的mRNA表达差异无统计学意义(P均>0.05)。康复新的浓度、作用时间对IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表达无影响。结论 康复新对巨噬细胞炎症反应有抑制作用，该作用不是通过抑制IL-6、TNF-α等致炎因子的表达，而是与降低PTGS2的表达有关。

关键词：炎症；康复新；抗炎；巨噬细胞；细胞炎症模型

康复新液主要成分为多元醇和肽[1]，具有抗炎、促进组织修复、抗肿瘤等作用[2]，已用于治疗儿科[3]、消化科[4]和口腔[5]的炎症性疾病，但关于其抗炎机制的相关研究很少。白细胞介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子(TNF)α是参与炎症过程的重要细胞因子，前列腺素(PG)内过氧化物合酶(PTGS)2是花生四烯酸转化为PG的关键酶[6]。本研究于2012年10月~2013年2月采用康复新干预细胞炎症反应模型，检测模型中炎症介质IL-6、TNF-α、PTGS2的表达，探讨康复新的抗炎机制。

1材料与方法

1.1材料小鼠巨噬细胞RAW264.7购于中国科学院昆明细胞库；康复新液由昆明赛诺制药有限公司生产；LPS、核因子-κB抑制剂BAY11-7082均购于Sigma公司；TRIzol Reagent购于美国Invitrogen公司；反转录试剂盒和PCR引物均购于大连Takara公司；荧光定量PCR试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液均购于以色列Bioind公司；二甲基亚砜(DMSO)购于安徽合肥Biosharp公司。

1.2细胞培养和分组取生长良好的RAW264.7，以3×105/孔接种于12孔细胞培养板，用10%FBS及1%双抗(100 U/mL青霉素+100 mg/L链霉素)的DMEM培养液在37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h后，弃去旧培养液，更换为含1% FBS及1%双抗的DMEM培养液继续培养12 h，经10% FBS及1%双抗的DMEM培养液继续培养。将上述细胞随机分为6组，每组设3个复孔，A组(加入DMSO 1 μL+DMEM 9 μL)、B组(加入DMSO 1 μL +DMEM 9 μL)、C组(加入10 mmol/L BAY11-7082 1 μL +DMEM 9 μL)、D组(加入1%康复新10 μL)、E组(加入0.1%康复新10 μL)、F组(加入0.01%康复新10 μL)，药物干预后细胞放入培养箱继续培养1 h，A组加DMEM培养液5 μL，其余各组加入LPS(100 μg/L) 5 μL诱导细胞炎症反应模型，造模后4、8 h收集细胞，拟提取RNA。D组在收集细胞时观察到细胞全部死亡，故未进一步检测。

1.3细胞中IL-6、TNF-α、PTGS2 mRNA检测采用qRT-PCR法。按TRIzol Reagent说明书提取细胞总RNA，按试剂盒说明合成cDNA。PCR反应体系为10 μL(混合物5 μL、上下游引物各0.2 μL、cDNA模板3 μL及RNase-Free水补足10 μL)。各引物的序列分别为：GAPDH：F 5′TGTGTCCGTCGTGGATCTGA3′,R5′TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG3′;IL-6：F5′CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA3′，R5′CCAGTTTGGTAGCATCCATCATTTC3′;TNF-α:F5′GACTAGCCAGGAGGGAGAACAGA3′,R5′CCTGGTTGGCTGCTTGCTT3′;PTGS2:：F5′TGCCAGGCTGAACTTCGAAAC3′,R5′GCTCACGAGGCCACTGATACCTA3′。95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火、延伸1 min，扩增35～40个循环。按照荧光定量PCR试剂盒说明检测各基因的表达，每组重复实验3次。对反应产物进行相对定量分析。以GAPDH为参照基因，根据公式2-ΔΔCT计算目的基因的相对表达量。

2结果

造模后4、8 h，与A组比较，B组IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表达均升高(P均<0.05)；与B组比较，C组IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表达均降低(P均<0.05)。D组在收集细胞时即观察到细胞全部死亡；与B组比较，E、F组IL-6、TNF-α的mRNA表达均升高，PTGS2的mRNA表达均降低(P均<0.05)；E、F组同时间点IL-6、TNF-α的mRNA表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)；同一浓度康复新组不同时间点IL-6的mRNA表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)，造模后8 h与4 h比较，TNF-α的mRNA表达降低(P均<0.05)；造模后4 h，E组与F组PTGS2的mRNA表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)，造模后8 h，F组PTGS2的mRNA表达低于E组(P均<0.05)；E组造模后8 h与4 h比较PTGS2的mRNA表达降低(P均<0.05)，F组造模后8 h与4 h比较PTGS2的mRNA表达差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

3讨论

IL-6和TNF-α被称为促炎细胞因子，可活化炎性细胞，增强其吞噬、杀伤功能，释放炎症介质，直接杀灭微生物。同时，参与宿主免疫反应，导致组织损伤。此外，IL-6和TNF-α属内源性致热原，可作用于体温调节中枢，引起发热[7]。花生四烯酸可通过环氧合酶PTGS2途径代谢为PG。PG在炎症过程中可使血管扩张、血管通透性升高而导致水肿；促进微静脉、毛细血管释放淋巴因子；另外PG还具有致热作用。目前研究发现，PTGS2与各种炎性毛细血管后微静脉的通透性、白细胞的趋化作用、T淋巴细胞产生及疾病的发生、发展有关[8]。故本研究通过LPS诱导RAW264.7制作细胞炎症反应模型，检测炎症介质IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表达水平。核转录因子κB(NF-κB)是细胞中重要的转录调节因子，通过刺激病毒、TNF、细胞活化因子、淋巴毒素等活化进而诱导多种基因的表达，产生多种细胞因子参与炎症反应[9]。NF-κB活化通路的抑制剂可以在慢性炎症和癌症的治疗中发挥重要的作用[10]。BAY11-7082是一种NF-κB抑制剂，可以通过阻断NF-κB信号通路的活化而起到抗炎作用，故本研究选择BAY11-7082作为阳性对照。本研究结果表明，LPS成功诱导RAW264.7发生了炎症反应，而BAY11-7082有效抑制了IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表达。

表1　各组造模后4、8 h细胞中IL-6、TNF-α、PTGS2 mRNA相对表达量比较±s)

注：与A组同时间点比较，aP<0.05；与B组同时间点比较，bP<0.05；与C组同时间点比较，cP<0.05；与同组造模后4 h比较，dP<0.05；与E组同时间点比较，eP<0.05。

从传统昆虫中药材蟑螂中提取的康复新具有理气散结、补气养阴、解毒生肌的功效。康复新通过多种机制产生了抗炎作用。陆允敏等[11]研究发现，康复新通过促进表皮生长因子表达修复黏膜，还可通过抑制激活蛋白-1、核因子、IL-4等炎性介质的表达产生抗炎作用。王路明等[12]研究结果显示，康复新能够降低单个核细胞IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF-α细胞因子表达，其抗炎机制可能是降低上述细胞因子的表达。实验显示，康复新有显著的镇痛作用，并对炎症引起的组织水肿和渗出具有明显抑制作用[13]。

本研究通过检测部分内源性炎症介质来探讨康复新的抗炎机制，与B组相比，E组和F组中IL-6、TNF-α的mRNA表达升高，而PTGS2的mRNA表达明显降低；与C组比较，E组和F组IL-6、TNF-α的mRNA表达差异有统计学意义，PTGS2的mRNA表达差异无统计学意义，提示康复新药液的抗炎机制不是通过降低致炎因子IL-6、TNF-α表达，可能是通过降低PTGS2的表达以抑制PG的产生发挥抗炎效应。本研究发现，造模后4 h时，F组与E组比较PTGS2的mRNA表达差异无统计学意义，造模后8 h，F组与E组比较PTGS2的mRNA表达显著降低(P<0.05)，结果未显示出抗炎效应与药物浓度有相关性；E组造模后4 h与8 h PTGS2 mRNA表达比较差异有统计学意义，而F组比较差异无统计学意义，结果不能得出抗炎效应与时间有相关性，但可表明康复新药效时间至少维持8 h。分析原因可能为康复新药液成分多且复杂，不能明确药液中具体起抗炎作用的成分，尚需进一步纯化获得其有效成分进行更深入的研究。

综上所述，体外实验证实，康复新可能抑制PTGS2的产生而发挥抗炎效应,而不是通过抑制致炎因子IL-6、TNF-α来产生抗炎效应。目前市场上的多种康复新液都是从美洲大蠊药材提取液中分离、精制而成的生物制剂，各个厂家康复新液在配方上会有一定差别。

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Anti-inflammatory effect and mechanism of Kangfuxin in inflammatory response of macrophages

TANGYanli1,ZHANGYuhao,LIGang,LIQiyan

(1TheFirstPeople'sHospitalofYunnanProvince,Kunming650032,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the anti-inflammatory effects of Kangfuxin in cell inflammation of macrophages and to discuss the possible mechanism. MethodsThe cultivated mouse macrophages RAW264.7 were randomly divided into 6 groups: group A (added with DMSO), group B (added with DMSO), group C (added with anti-inflammation drug BAY11-7082), group D (added with 1% Kangfuxin), group E (added with 0.1% Kangfuxin), and group F (added with 0.01% Kangfuxin). We continued to cultivate for 1 h after drug intervention, group A was treaded with DMEM, the other groups were treated with LPS (100 μg/L) to induce cell inflammation. The cells were collected after treatment of 4 h and 8 h, the mRNA expression levels of IL-6, TNF-α and prostaglandin-endoperoxide synthase (PTGS2) were detected by qRT-PCR. ResultsFour hours and eight hours after modeling, compared with group A, the mRNA expression levels of IL-6, TNF-α and PTGS2 were increased in the group B (all P<0.05); compared with group B, the mRNA expression levels of IL-6, TNF-α and PTGS2 were decreased in the group C (all P<0.05). All cells were dead in the group D.Compared with group B, the mRNA expression of IL-6 and TNF-α was increased and the PTGS2 mRNA expression was decreased in the groups E and F (all P<0.05). Compared with group C, significant difference was found in the mRNA expression of IL-6 and TNF-α between groups E and F (all P<0.05), and no significant difference was found in the mRNA expression of PTGS2 between groups E and F (all P>0.05). The concentration and duration of Kangfuxin had no effect on the mRNA expression of IL-6, TNF-α and PTGS2.ConclusionKangfuxin has inhibitory effect on the cell inflammatory reaction, and its mechanism may be not related with the inhibition of expression of inflammatory factors, such as IL-6 and TNF-α, but be related with the down-regulated PTGS2 expression.

Key words:inflammation; Kangfuxin; anti-inflammation; macrophages; inflammatory response model

(收稿日期：2015-12-23)

中图分类号：R364.5

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)09-0013-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.005

通信作者简介：李启艳(1971-)，女，主任医师，博士，主要研究方向为牙周病的治疗。E-mail：ynliqiyan@aliyun.com

作者简介：第一汤雁利(1983-)，女，主治医师，硕士，主要研究方向为牙周病的治疗。E-mail：3937394@qq.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81160134)；云南省中青年学术和技术带头人后备人才资助项目(2012HB027)；云南省医学学科带头人资助项目(D-201232)。