转基因植物检测技术研究进展

王慧远，贾维薇，陈庆河

(1.南京市金陵中学　210005； 2.福建省农业科学院植物保护研究所)



转基因植物检测技术研究进展

王慧远1，贾维薇1，陈庆河2

(1.南京市金陵中学210005； 2.福建省农业科学院植物保护研究所)

摘要：对国内外转基因植物及产品的检测技术进行综述，重点介绍目前使用较广泛的PCR技术、酶联免疫吸附技术、环介导等温扩增技术、基因芯片技术及其他转基因检测技术的原理和特点，并展望今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。

关键词：转基因植物；检测技术；核酸；蛋白质

转基因技术是指通过体外重组DNA技术将外源基因转入到生物体的细胞或组织中，由于导入基因的表达引起生物体的性状可遗传性修饰，从而使再生生物体获得新的遗传特性。这一技术打破了生物的种间隔离，大大扩大了物种之间的基因交流范围[1]。

自1983年首次报道植物的遗传转化以来，大批转基因植物新品种不断涌现，获得了极大的经济和社会效益。据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)统计，2014年全球转基因作物的种植面积为1.815亿hm2[2]，这与1996年的1700万hm2相比，增幅超过10倍。然而，随着转基因作物及其产品的大规模商业化，其安全性及对人类健康和生态环境的潜在威胁受到国际社会和广大民众的广泛关注。转基因生物需要进行安全评价, 而转基因检测技术是其研究和安全管理的基础和技术保障。因此,研究转基因动植物产品检测技术,建立转基因生物安全检测技术体系, 成为目前亟待解决的关键问题。

目前转基因检测技术主要是基于核酸的检测方法和基于外源蛋白靶标的检测方法，如PCR法、酶联免疫吸附法、生物传感器、基因芯片等。这些方法在不同转基因产品检测应用中各有优缺点。本文重点综述转基因植物及产品检测技术的研究进展，并展望今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。

1基于核酸的检测技术

1.1定性PCR检测技术

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是20世纪80年代中期由Mullis发展起来的体外核酸扩增技术，广泛用于外源基因检测、目的基因标记、功能基因分离和克隆等。该技术以极少量目标DNA为模板，加入目标基因特异性引物，在DNA聚合酶作用下，由高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的 DNA片段得以迅速扩增。该技术可根据目的基因、标记基因序列设计PCR引物，从转基因植株中扩增外源基因片段，而非转基因植物基因组则不能扩增出相应的目标片段。目前，PCR技术被用于转基因大豆[3]、转基因小麦[4-6]、转基因玉米[7]和转基因油菜[8]等植物的检测。

由于PCR检测所需的DNA量少、纯度要求不高、操作简单、成本低、实验安全，是目前转基因检测不可或缺的方法。但是，PCR检测易出现假阳性结果。引物设计不合理，外源DNA插入后的重排或变异，靶序列或扩增产物的交叉污染等因素都会造成检测的误差。而且对于量少和受到严重破坏的核酸样本，其DNA遭受比较严重的破坏，再加上转基因DNA成分受到大幅度的稀释，采用普通PCR技术往往难以检测，因此提高PCR检测灵敏度对准确标定食品是否含有转基因成分尤为关键。在普通PCR基础上发展而来的巢式和半巢式PCR(nested and semi-nested PCR)检测技术，针对同一模板，利用2对引物，进行2次特异扩增，可显著提高检测的特异性和灵敏度，在转基因检测中得到了应用[9]。此外，由于商品化转基因生物的种类不断增加，所涉及的基因不断增多，普通PCR检测技术1次反应只能针对1个目标序列，难以满足转基因成分快速检测的需求。多重PCR (multiplex PCR) 检测技术能够实现在同一个反应管里进行2对或2对以上的引物针对不同的DNA序列进行扩增，与普通PCR相比，具有提高检测通量、节约模板和试剂、缩短检测时间等优点，目前也已经被应用到转基因检测中[10-11]。

1.2定量PCR检测技术

目前许多国家实行转基因产品标识制度，规定转基因成分的最低含量阈值，如日本、俄罗斯等国是5%，欧盟是0.9%[12]。因此，必需对转基因产品进行定量检测。目前已发展出以植物内源基因作参照的实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)和数量竞争性PCR(QC-PCR)技术。

RT-PCR技术能实现核酸含量的定量检测，基本原理是在PCR反应体系中加入荧光标记基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后利用标准曲线对待测模板进行定量检测。根据所采用的荧光基团发光原理的不同，主要分为SYBR Green I荧光染料法和TaqMan探针法。RT-PCR 技术已成功应用于转基因大豆、玉米和甜菜等作物转基因成分的检测，其检测灵敏度可达0.01%以下[13]。白卫滨等[14]用RT-PCR技术成功检测出美国、阿根廷、巴西和中国转基因豆粉的转基因成分，其灵敏度为0.001%。王小花等[15]利用RT-PCR方法监测大豆转基因成分，检测限为0.01%。RT-PCR具有重复性好、灵敏度高、核酸交叉污染少、易于自动化等优点，有效解决了传统定量只能终点检测的局限，但定量标准物研究还相对滞后，且对仪器设备要求较高，检测费用昂贵。因此其普及应用在一定程度上受到制约。

QC-PCR是一种定量PCR，通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板，以控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板做定量研究。目前已建立对NOS终止子、CaMV35S启动子、Roundup Ready大豆等转基因作物的竞争性PCR检测方法[16-17]。QC-PCR对实验仪器要求不高，但需要用基因重组技术构建内标竞争DNA，而且要求做多个标准样品的对照，对普通实验室来说难度很大。

1.3环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等[18]在2000年开发的一种新颖恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用Bst DNA polymerase聚合酶在等温条件(65℃)下保温1 h，即可完成核酸扩增反应。近年LAMP技术已广泛应用于包括DNA病毒、RNA病毒、细菌和寄生虫等传染性疾病的定性和定量检测[19-20]。田芳等[21]应用LAMP技术成功检测出大豆、豆粕及含有大豆成分的饲料样品中的CP4-EPSPS基因，灵敏度为PCR方法的100～1000倍。LAMP不需要热循环, 为等温扩增，扩增效率可达到109～1010数量级,具有操作简单、特异性强、等温灵敏、产物易检测等优点[18]。缺点是引物设计较为复杂，对扩增产物处理不当容易造成DNA污染，影响后续的实验结果。

1.4基因芯片技术

基因芯片技术是近年来快速发展起来的分子生物学高新技术。在转基因检测中，将目前使用的报告基因、启动子、终止子的特异性片断制成检测芯片，与待测产品的DNA进行杂交，扫描信号后经计算机软件分析，实现对生物样品快速、高效的检测。Leimanis等[22]建立了针对转基因大豆的CaMV35S、NOS标记基因元件的高灵敏度基因芯片检测技术。基因芯片技术具有高通量、灵敏度高、特异性强等优点，且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因作物[23]。其缺点是制作基因芯片技术复杂，成本高昂，需要专门的仪器设备，要求操作人员具有较高的专业素质，这些因素限制了该技术在检测中的广泛应用。

2基于蛋白的检测技术

2.1蛋白免疫印迹杂交技术

蛋白免疫印迹杂交技术(Western Blot)是检测转基因作物外源蛋白表达的经典方法，是一种蛋白质转移电泳技术，其原理是把经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离的目的蛋白原位固定于固相膜上，再用高浓度的蛋白质溶液孵育固相膜，然后用含有放射性标记或酶标记的特定抗体进行杂交，使抗原—抗体特异性结合，最后通过放射自显影或者显色观察外源基因的表达，根据检出结果可得知目的蛋白是否表达、浓度大小及分子量大小。Qiu等[24]采用Western blot检测转基因水稻中稻瘟菌蛋白激发子的表达，证明该蛋白的过表达增强了水稻抗病性。Western blot技术普遍用于分离、检测特异的目的蛋白质，具有很高的灵敏性。但是其操作过程繁琐，费用昂贵，适合应用于研究，不适用于常规实验和大量样品的检测。

2.2酶联免疫吸附检测技术

酶联免疫吸附检测技术(ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶的高效催化反应有机结合起来的一种高灵敏度的检测技术。其原理是特殊的抗体被结合固定在固体表面，如微孔板上，加入样品，洗去未被结合的成分。然后加入酶的抗体进行抗原检测，再次洗去未被结合的成分，样品中抗原的含量与酶和底物反应的颜色成正比。ELISA有直接法、间接法和双抗夹心法之分，目前使用最多的是双抗夹心法，其灵敏度最高。该方法已在大豆、辣椒、烟草、水稻等多种转化植株的检测中应用[25-27]。ELISA方法具有简便、快速、成本低等优点，但其准确性易受复杂基质干扰，检测范围受限制。

2.3免疫试纸条检测技术

免疫试纸条法是将特异的抗体交联到试纸条和有颜色的物质上，当纸上抗体和特异抗原结合后，再与带有颜色的特异抗体进行反应，形成三明治状的色带，如果没有抗原，则无颜色反应。已经有商品化的针对大豆、油菜、棉花和甜菜等转基因作物中的抗除草剂基因CP4-EPSPS的检测试纸条。丁耀魁等[28]采用快速检测试纸条测定大豆转基因含量，测定时间仅需10 min，结果准确，其检出限可以达到0.1%。试纸条法优点是成本低廉，操作简单、迅速，不需要特殊的仪器设备，适用于现场检验或初筛。但是该方法的缺点是检测范围较小，加工后的转基因产品中的蛋白质抗原性容易被破坏，影响检测结果的准确性。

2.4蛋白质芯片技术

蛋白质芯片技术是继基因芯片技术后发展起来的生物检测技术，是蛋白质组学研究中除了酵母双杂交、双向电泳技术、质谱技术等之外的一种重要的工具。蛋白质芯片技术是将已知序列的蛋白、多肽分子、抗原、抗体、酶以预先设计的方式固定在硝酸纤维素膜、玻璃、硅片等载体上排列，待荧光标记的靶分子和探针分子结合后，利用激光扫描系统对荧光信号进行强度检测分析。该技术目前主要用于药物学、临床、细胞周期调控等领域，同时为转基因植物蛋白的检测提供了有效手段[29]。蛋白质芯片技术具有快速、平行、自动化等优点，且检测到的平行数据误差更小、更准确，这对于高通量研究具有非常重要的意义。

3展望

转基因技术被称为“人类历史上应用最为迅速的重大技术之一”。同时，转基因技术作为现代农业生物技术的核心，在缓解资源约束、保障食物安全、保护生态环境、拓展农业功能等方面已显现出巨大潜力。转基因技术既给人类带来了巨大的经济效益，同时也引发了社会关于转基因植物安全性问题的争议。转基因成分检测技术是转基因产品安全性管理和标识的技术保障，也是消除公众对转基因植物安全质疑的重要环节。近年来，虽然不断有新的检测技术出现，但大多数方法处于发展阶段，还不能有效地运用到实际工作中。所以，亟待建立快速、有效、准确的转基因检测技术体系，使转基因检测技术向高通量、高灵敏度、自动化的方向发展。

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(责任编辑：林芸青)

收稿日期：2015-12-15

作者简介：王慧远，女，1997年生。

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.01.026

Research progress on the detecting technique of transgenic plants

WANG Hui-yuan1, JIA Wei-wei1, CHEN Qing-he2

(1.JinglingHighSchool,JiangsuProvince210005; 2.InstituteofPlantProtection,FujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianProvince350003)

Abstract:Detecting technique for transgenic plants and products home and abroad were summarized, emphatically introduced the principal and character of widely applied technologies, including Polymerase chain reaction (PCR) technique, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique, gene chip technique and other detecting technique, and the developing trends and research directions were proposed in this paper.

Key words:Transgene plant; detecting technique; nucleic acid; protein