琥珀酸的生物制造：细菌还是酵母？

李娇娇 祁庆生（山东大学微生物技术国家重点实验室，济南 250100）



琥珀酸的生物制造：细菌还是酵母？

李娇娇 祁庆生
（山东大学微生物技术国家重点实验室，济南 250100）

祁庆生，教授，德国明斯特大学微生物学博士，2001年被聘为德国开姆尼茨工业大学生物工程系课题组负责人。2004年回国任山东大学微生物技术国家重点实验室教授，博士生导师；国家糖工程技术研究中心研究员，山东大学微生物研究所所长。2006年获教育部“新世纪优秀人才”。主持国家自然科学基金、教育部重点项目、国家863项目、973子课题等多项。主要从事工业微生物的代谢途径设计、代谢工程改造以及合成生物学等方面的研究。在国际国内著名学术期刊上发表论文100余篇，申请和获得国家发明专利20余项。

E-mail:qiqingsheng@sdu.edu.cn

琥珀酸又称丁二酸，是一种重要的有机合成中间体。许多微生物都可以通过优化和代谢工程改造产生琥珀酸。文章对细菌和酵母两种主要的产琥珀酸类群产琥珀酸的产量、产率及后提取等因素进行了详细的分析，并比较了两种微生物生产琥珀酸 各自的优缺点，为今后开发利用琥珀酸的生物制造提供参考。

1 琥珀酸简介

琥珀酸又称丁二酸，是一种安全的天然有机酸，并且被美国能源部认为是未来12种最具价值的生物炼制产品之一。琥珀酸可以广泛地应用于清洁剂、表面活性剂、食品添加剂、抗菌剂以及制药行业，并用以合成多种重要化学品，如γ-丁内酯、1，4-丁二醇、四氢呋喃和2-吡咯烷酮等①②。同时，作为一种重要的有机合成中间体，琥珀酸还是合成多种聚酯（例如可降解聚酯PBS）的重要前体物质③。琥珀酸近年来逐渐攀升为大宗化学品，全球琥珀酸的年产量在3万～5万吨④。根据MarketsandMarkets的调查报告，琥珀酸的市场需求在2011～2016年间会以18.7%的速率稳定增长。

传统上琥珀酸是化学合成的。该过程需要金属Pd和Ru的催化，通过丁烷制备顺式丁烯二酸酐再经化学方法加工而成⑤。但由于石油资源的减少和环境污染问题，人们开始寻求一种资源可再生的、高效环保的琥珀酸生产方式。而琥珀酸是微生物细胞中心代谢三羧酸循环（TCA）的中间代谢产物之一，并且还是多种兼性厌氧菌和严格厌氧菌的代谢末端产物，可以通过微生物利用可再生的碳水化合物资源进行生产。

2 产琥珀酸的细菌

许多天然生产琥珀酸的菌株是从瘤胃中分离出来的，如产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、曼海姆产琥珀酸菌、脆弱杆菌。这些菌株都是兼性厌氧或者严格厌氧的革兰阴性菌，嗜温、嗜CO2，并且对高浓度的琥珀酸有着良好的抗渗透压性能⑥⑦。产琥珀酸放线杆菌能够利用多种碳源发酵，并且对葡萄糖和琥珀酸的耐受性可以高达158g/L和104g/L⑧。Guettler等⑨以葡萄糖为碳源用产琥珀酸放线杆菌厌氧发酵生产琥珀酸，产量可达106g/L，产率接近0.9g/g。对产琥珀酸厌氧螺菌的研究大多数集中在利用多种碳源为原料及菌株优化方法上⑩。Meynial-Salles等⑪用产琥珀酸厌氧螺菌进行连续的厌氧发酵得到83g/L的琥珀酸，琥珀酸的生产力达到10.4g/（L·h）。另外一种瘤胃细菌曼海姆产琥珀酸菌也可以利用多种碳源生产琥珀酸。与产琥珀酸放线杆菌不同的是，曼海姆产琥珀酸菌能够有氧生长，有完整的TCA循环。曼海姆产琥珀酸菌的琥珀酸生产能力弱于上述两种天然宿主菌，文献中报道的其琥珀酸产量大多在十几克⑫⑬。而据报道，BASF/Purac JV公司分离得到的一种脆弱杆菌，可以高效生产琥珀酸。

参考文献① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ ⑪ ⑫ ⑬ ⑭ ⑮ ⑯ ⑰ ⑱ ⑲ ⑳ ㉑ ㉒ ㉓ ㉔ ㉕ ㉖ ㉗ ㉘ ㉙ ㉚ ㉛ ㉜ ㉝

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因为在自然界中这些微生物存在于氨基酸和维生素丰富的地方，天然生产琥珀酸的瘤胃菌株有许多营养缺陷型菌株，所以这些菌株的生长需要昂贵、营养丰富的培养基，导致琥珀酸的生产成本增加⑦。为了解决这些问题，人们开始采用遗传背景研究清楚的、非天然生产琥珀酸的工业生产菌株例如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌，经过代谢工程改造生产琥珀酸。

谷氨酸棒杆菌是一种生长良好、安全易于控制的生产宿主，多用于氨基酸的大规模生产⑭。谷氨酸棒杆菌可以通过双阶段发酵，在厌氧时还原的TCA途径产生琥珀酸。通过细胞循环的分批补料发酵方式，琥珀酸的产量高达146g/L，产率达到1.4mol/mol⑮。Litsanov等⑯以葡萄糖、甲酸和碳酸氢盐为底物发酵得到134g/L琥珀酸，产率达到1.67mol/mol。由此可见，利用谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸具有一定优势，但是由于生产过程需要有氧-厌氧双阶段，会导致全阶段琥珀酸产率较低，并且有氧阶段会大大增加琥珀酸的生产成本。

大肠杆菌是一种兼性厌氧菌。厌氧条件下，野生型大肠杆菌进行混合酸发酵，产物包括甲酸、乳酸、乙酸、乙醇，以及少量的琥珀酸⑰。有氧条件下生产琥珀酸需要失活琥珀酸脱氢酶（SDH），阻断TCA循环中间体琥珀酸向下游转化，也可以通过打开乙醛酸支路来积累琥珀酸。在有氧条件下，以葡萄糖为碳源生产琥珀酸得率为1mol/mol⑱。而厌氧条件下的琥珀酸发酵是通过还原的TCA支路和部分乙醛酸支路进行，其中还原支路需要固定一分子CO2，因此厌氧发酵有助于减少温室气体的量，是一种环境友好型生物过程，其理论产率为1.714mol/mol，在额外补充足够还原力的情况下理论产率更可以达到2mol/mol⑱。鉴于此，厌氧是高效产琥珀酸的发酵方式。笔者实验室构建的工程菌YL106/pSCsfcA以葡萄糖为底物进行全阶段发酵，琥珀酸生产力达2.13g/（L·h），琥珀酸产量达到85.3g/L，产率超过0.88g/g⑲。天津工业生物技术所张学礼等⑳通过代谢进化技术构建高效生产琥珀酸的菌株HX024，厌氧发酵琥珀酸的产量达到96g/L。然后又利用反向代谢工程技术，在出发菌株中激活磷酸戊糖途径、转氢酶和丙酮酸脱氢酶，提高菌株还原力NADH的供应，厌氧发酵琥珀酸的产率提高到1.5mol/mol（理论产率的88%）⑳。此前该课题组与山东兰典生物科技股份有限公司合作完成了琥珀酸10m3发酵罐中试，琥珀酸产率达1.0g/g，提取收率达82%，纯度达99.5%以上。Myriant公司也用工程化的大肠杆菌生产琥珀酸，据称2013年产量达到13 600吨。Myriant还与中国蓝星集团合资生产琥珀酸。

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3 产琥珀酸的酵母

细菌的培养和发酵需要一个接近中性的环境，所以大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌等发酵生产琥珀酸的过程中需要不断添加碱来维持pH稳定。这会增加发酵过程中染菌的概率，使琥珀酸的下游工业处理（DSP）过程更加复杂，造成琥珀酸分离成本增加⑦㉑。而酵母生长良好，性能优良稳定，且可以在弱酸性条件下生长，对各种工业条件下的压力都有显著的抵抗性，如耐酸性、抗渗透性和耐高底物水平。

酿酒酵母的底物来源广泛，培养条件可以有氧也可以厌氧。在酵母中生产琥珀酸最初是为了改善酿酒酵母所产的酒的风味，研究主要集中在TCA循环中的琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶（FUM）等，最终产量小于0.7g/L㉒。有氧条件下，酿酒酵母的还原TCA还原支路在热力学上不易发生，并且催化草酰乙酸生产琥珀酸的酶受到葡萄糖的抑制㉓。因此许多研究都集中在酿酒酵母在厌氧条件下生产琥珀酸。通过敲除琥珀酸脱氢酶和延胡索酸酶来阻断线粒体TCA循环积累琥珀酸㉔㉕。也可以通过敲除琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶（IDP1）利用氧化的TCA循环和乙醛酸途径共同积累琥珀酸㉖。与大肠杆菌类似，酵母的厌氧理论产率高于有氧理论产率。Yan等㉗敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶（PDC）、延胡索酸酶基因，并且优化胞质内还原TCA支路各步骤的酶，得到12.97g/L琥珀酸，产率为0.21mol/mol葡萄糖，发酵pH维持在3.8。Verwaal等㉘也通过相似的方法，利用酿酒酵母还原的TCA途径生产琥珀酸，产量达到43g/L。工业生产中，DSM/Roquette合资公司以酿酒酵母为生产菌株，但没有获得其最终生产指标。

解脂耶氏酵母是被广泛研究的一类非惯用酵母，严格好氧，需利用完整的TCA循环来维持生长㉙。解脂耶氏酵母可以利用的底物很广泛，如葡萄糖、乙醇、脂肪酸、油脂和正构烷烃等，因为它能积累大量的有机酸，尤其是TCA循环的中间体柠檬酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸等，是一种重要的工业菌株。一些学者通过突变琥珀酸脱氢酶，筛选酶活力降低的突变株来积累琥珀酸㉚。Kamzolova㉛以构建好的α-酮戊二酸解脂酵母为生产菌株，以乙醇为底物在过氧化氢存在的情况下脱羧生产琥珀酸，琥珀酸的产量为71.7g/L，并且发酵液中琥珀酸的回收率达到72%。Yuzbashev等㉚利用突变了琥珀酸脱氢酶的解脂酵母，以甘油为底物、碳酸钙为缓冲剂进行低pH琥珀酸发酵，得到45g/L的琥珀酸。笔者实验室构建的琥珀酸脱氢酶突变的解脂酵母以甘油为底物，通过长时间发酵最后得到160g/L琥珀酸，说明其对琥珀酸具有较高的耐受力（文章在投）。

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4 细菌与酵母琥珀酸生物制造过程比较

表1　琥珀酸生产菌株发酵能力比较

目前，在琥珀酸的产量、产率和生产力方面，细菌都具有一定的优势，而报道的酵母生产琥珀酸的产量、产率和生产力都不高（表1）。酿酒酵母具有较好的耐受能力，特别是对pH的耐受性较高，而细菌对酸和渗透压力耐受性低，发酵过程中需要调节pH，这会增加生产成本，也使发酵过程更易染菌。然而，酵母维持细胞外大量的琥珀酸以游离状态存在，将需要消耗胞内的能量来维持胞内pH和阻止酸顺浓度梯度的跨膜运输。这种额外消耗能量对酵母的厌氧生产过程不利，因为酵母厌氧过程产生的ATP很少，主要依赖底物水平磷酸化而非有氧时的氧化磷酸化。作为弱酸，琥珀酸在低pH的培养基中会转换为不溶的形式，与带电分子的形式相比，不溶的琥珀酸可以通过被动扩散穿过胞质膜进入细胞。为了解决这一问题，研究者提出微好氧发酵这一策略，使一部分底物通过氧化磷酸化，产生的ATP可以补充厌氧支路ATP缺少的情况㉚。

表2　细菌与酵母琥珀酸制造过程比较

影响琥珀酸生产成本的最主要阶段是琥珀酸提取纯化阶段（表2）。细菌发酵中得到的琥珀酸盐需要转化为游离琥珀酸，该阶段的成本大概占到产物成本的60%～70%㉜。酵母可以进行低pH的生物发酵，除去菌体后的发酵液可以直接蒸发结晶，而需要中性环境的细菌生产琥珀酸过程，要先进行电渗析或者酸化超滤过程再蒸发结晶，其中电渗析过程需要大量能量，酸化过程还会有副产物硫酸铵的产生㉝。酵母低pH（小于3）的生物发酵直接把底物转化为琥珀酸，这使产物的下游处理步骤少于细菌发酵。综上所述，就目前琥珀酸的产量、产率与生产力而言，工程化的大肠杆菌似乎更具有优势。但是，从长远来看，考虑到工业生产成本，如果解决了酵母生物转化的产率和生产力较低的问题，也许酵母比大肠杆菌更适于琥珀酸的生物制造。

[致谢：本项目得到了国家自然科学基金(31170097)，山东省科技发展计划(2015GSF121042)及微生物技术国家重点实验室(M2014-03)的资金支持。]

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作者简介

doi:10.3969/j.issn.1674-0319.2016.01.004