铵盐对紫色红曲霉合成代谢红曲色素及桔霉素的影响

岳建明，杨 强，肖 潇，尹 胜，张 婵，王成涛,*，胡济美，赵吉兴（.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心，食品营养与人类健康北京高精尖创新中心，北京 00048；.中国国际工程咨询公司，北京 00048；.山东中惠生物科技股份有限公司，山东 滨州 5706）



铵盐对紫色红曲霉合成代谢红曲色素及桔霉素的影响

岳建明1，杨 强1，肖 潇1，尹 胜1，张 婵1，王成涛1,*，胡济美2，赵吉兴3
（1.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心，食品营养与人类健康北京高精尖创新中心，北京 100048；2.中国国际工程咨询公司，北京 100048；3.山东中惠生物科技股份有限公司，山东 滨州 251706）

摘 要：研究紫色红曲霉（Monascus purpureus）Y20液态发酵过程中不同铵盐对目的产物红曲色素及有害物质桔霉素的合成代谢的影响。在发酵培养基中添加不同铵盐，检测M.purp ureus Y20发酵液中红曲红色素、红曲黄色素及桔霉素含量，分析其变化及原因。结果表明：M.purpureus Y20发酵过程中发酵液pH值相对较稳定，未添加铵盐的对照组发酵液基本维持在pH 4.8；添加CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3的发酵液pH＞6；添加NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl的发酵液初始pH＜5.5，发酵过程中持续降低至pH 2.5左右；含有0.3 mol/L NH4＋的(NH4)2SO4的发酵液中桔霉素含量降为0.05 mg/L，较对照组降低88.6%；含有0.1～0.3 mol/L NH4＋的NH4Cl发酵液中桔霉素含量降为0.05 mg/L；含有0.3 mol/L NH4＋的NH4NO3发酵液未检出桔霉素，红曲黄色素含量较对照组升高31.0%、红曲红色素含量降低11.6%；添加CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3的发酵液无桔霉素检出，但菌体干质量较小，色价较低。因此，添加铵盐可影响发酵液pH值，影响M.purpureus Y20对营养物质吸收和代谢，改变红曲色素的组成比例和抑制桔霉素的生成；添加适量(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3有利于促进红曲黄色素的生物合成，阻碍桔霉素的生成。

关键词：紫色红曲霉；红曲红色素；红曲黄色素；桔霉素；铵盐

引文格式：

岳建明,杨强,肖潇,等.铵盐对紫色红曲霉合成代谢红曲色素及桔霉素的影响[J].食品科学,2016,37(5):102-107.

YUE Jianming,YANG Qiang,XIAO Xiao,et al.Effect of addition of ammonium salts to culture medium on the biosynthesis and metabolism of pigments and citrinin in Monascus purpureus[J].Food Science,2016,37(5):102-107.(in Chinesewith English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605019.http://www.spkx.net.cn

红曲在中国已有300a以上的食用历史。红曲色素作为重要食品着色剂已被亚洲及欧美各国广泛使用[1-2]，也是我国传统出口产品。随着红曲产品的推广，人们对红曲的研究也不断深入，红曲产品中一些有害物质，逐渐引起人们的关注。1995年，Blanc等[3]用质谱、核磁共振、紫外及荧光分析等多种方法对红曲产品中的抑菌因子Monascidin A进行定性分析和结构测定，证明Monascidin A是桔霉素（citrinin）。研究证实，桔霉素是一种真菌毒素，作用的主要靶器官是肾脏，能引起实验动物的肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状，对人体有较大危害[4-6]。我国国家标准（GB/T 5009.222—2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》）建立了桔霉素检测方法，但并未对桔霉素控制指标做出限定。欧美各国针对我国出口的红曲产品制定新标准，严格限制其中的桔霉素含量。如德国要求从中国进口的红曲必须有安全生产菌种及不含桔霉素的证明[7]。因此如何降低红曲产品中桔霉素的含量，已经成为红曲色素研究领域的重点和限制出口的瓶颈问题，亟待解决。

红曲色素是红曲霉的次级代谢产物，主要包括红曲红色素、红曲黄色素2 种色素，从结构上看包括脂肪酸和多聚酮2个部分，通过多聚酮合成途径，产生生色团；脂肪酸合成途径产生中长链脂肪酸，经转酯化作用将其连接到生色团上[8-9]。红曲色素和桔霉素合成的关键酶同为聚酮体合成酶（polyketide synthetases，PKSs），因此两者的生成量成一定的正相关[10]。目前国内外对红曲色素合成代谢有一些报道，从红曲色素合成关键酶、发酵工艺控制、诱变育种、基因工程等多个层面开展研究[11-13]。本实验研究紫色红曲霉的红曲色素合成代谢途径及其调控机制，发现铵盐对紫色红曲霉发酵过程中有害物质桔霉素的生成、红曲色素的合成代谢有调控作用。研究结果对于红曲色素代谢调控具有一定指导意义，有利于我国传统红曲产业的发展。

1 材料与方法

1.1菌株与试剂

紫色红曲霉（Monascus purpureus）Y20，由食品质量与安全北京实验室选育。

大米粉成都半夏科技有限公司；葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、NaNO3（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨、琼脂、酵母提取物 北京奥博星生物技术有限责任公司；豆粕粉、玉米浆、麦芽浸粉 天津市利发隆化工科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯） 赛默飞世尔科技（北京）有限公司；桔霉素标品（纯度≥98%） 美国Sigma公司；NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3（均为分析纯） 西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

HDL洁净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；BSA224S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HZQ-F160全温振荡培养箱 太仓市试验设备厂；TGL-10C高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；PHS-3D 型pH计 上海三信仪表厂；UV-2450紫外-可见分光光度计、LC-20AT高效液相色谱 日本岛津公司；HH-4恒温水浴锅 江苏省荣华仪器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1培养基的制备和紫色红曲霉的培养

斜面培养基：葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、酵母提取物0.4%、麦芽浸粉2%、琼脂2%、KH2PO40.2%、NaNO30.2%、MgSO40.1%，121 ℃灭菌20 min。

种子培养基：大米粉4%、蛋白胨0.8%、豆粕粉0.5%、KH2PO40.2%、NaNO30.2%、MgSO40.1%，接种摇瓶培养，装液量为50 mL/250 mL三角瓶，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：大米粉7.7%、葡萄糖7.5%、豆粕粉0.2%、KH2PO40.05%、NaNO30.18%、MgSO40.1%、玉米浆0.35%，装液量为200 mL/500 mL，121 ℃灭菌20 min。NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3分别按照NH4＋浓度0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L添加。

试管斜面刮取适量新鲜菌丝体，30 ℃、200 r/min摇瓶培养2 d；将种子液按体积分数10%接种到发酵培养基，33 ℃、200 r/min摇瓶培养8 d[14]。

1.3.2色价的测定

量取1 mL发酵液加入9 mL 70%的乙醇溶液，恒温水浴锅60 ℃浸提1 h，4 000 r/min离心10 min，取上清液稀释至2 000倍，紫外分光光度计测定410、505 nm波长处的吸光度。410 nm波长处测定为红曲黄色素含量，510 nm波长处测定红曲红色素含量[15-16]。实验组发酵液中分别添加NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3至NH4＋浓度为0.1～0.4 mol/L，探究铵盐对红曲色素合成代谢的影响。

红曲色素的色价/U=吸光度×稀释倍数

1.3.3生物量的测定

将烘干的3层纱布称质量，将10 mL发酵液通过纱布过滤，蒸馏水冲洗至洗出液无色，将纱布置于烘箱中过夜烘干至恒质量，精密电子天平称量得菌体干质量，以单位体积发酵液中的菌体干质量计算生物量[17-18]。

1.3.4桔霉素含量的测定

取1 mL发酵液加入9 mL无水乙醇，210 W，40 Hz超声处理20 min后，恒温水浴锅60 ℃浸提1 h。将发酵液4 000 r/min离心10 min，取上清液0.45 øm有机滤膜过滤。

液相色谱条件：YMC-Triart C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5øm）；荧光检测器的激发波长为λex＝331 nm，发射波长λem＝500nm；V（乙腈）∶V（水）＝35∶65作为流动相，磷酸调节pH2.5；柱温28℃；流速1.2mL/min；进样量20øL。

精确称取桔霉素标准品0.001 g，50 mL容量瓶中甲醇定容配制20 mg/L标准溶液，分别稀释为0.05、0.2、2、4、8、12 mg/L标准溶液，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测绘制桔霉素标准曲线[19-20]。根据桔霉素标准品质量浓度和峰面积求回归方程和相关系数，其标准曲线方程为：Y＝36 537X＋7 247（R2＝0.9997），式中：X为桔霉素质量浓度/（mg/L）；Y为峰面积。表明桔霉素在0.05～12 mg/L范围内线性关系良好。向发酵液中添加桔霉素标样溶液至2 mg/L，5 次测定桔霉素质量浓度为（1.932±0.011）mg/L，变异系数为0.57%，平均回收率为96.6%，说明该方法准确性、精密度良好。

2　结果与分析

2.1M.purpureus Y20的酸碱耐受性

用乳酸调节培养基不同的起始pH值，其余条件与液体发酵培养基相同。测得第8天M.purpureus Y20发酵液pH值与发酵液的菌体生物量关系如图1所示。

图1　不同pH值发酵条件下M.purpurreeuuss Y20 的生物量Fig.1 Biomass of M.purpureus Y20 under different pH conditions

由图1可知，M.purpureus Y20的最适pH值在4.5左右。当pH＞6.5和pH＜2.5时，红曲霉菌体的生长均受到较大程度抑制。

2.2不同铵盐对M.purpureus Y20发酵液pH值的影响

图2　不同铵盐对M.purpurreeuuss Y20发酵过程中pH值的影响Fig.2 Effect of ammonium salts on pH during M.purpureus Y20 fermentation

由图2（图示仅给出效果明显的2 种NH4＋浓度：0.1 mol/L和0.3 mol/L）可知，未添加铵盐的对照组发酵液pH值在发酵前期稍有下降，发酵中后期基本维持在4.8左右，这表明紫色红曲霉发酵过程中发酵液pH值相对稳定；添加CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3的实验组发酵液初始pH＞7，发酵过程中维持pH＞6，是因为这3 种铵盐的阴离子同为弱酸根离子，在水溶液中电离溶液成弱碱性；添加NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl实验组发酵液初始pH＜5.5，是因为这3 种铵盐的阴离子同为强酸根离子，NH4＋在水溶液中电离成弱酸性。添加铵盐的实验组的pH值在发酵过程中均持续下降，这可能是因为NH4＋作为氮源被微生物利用时，NH4＋被跨膜吸收，导致胞内H＋跨膜交换外流[21]，使发酵液pH值下降，且以添加(NH4)2SO4的发酵液pH值变化最为明显。这表明发酵液pH值对微生物的营养物质吸收和代谢有重要调控作用，也可能影响某些关键代谢酶基因表达水平、代谢产物形成、分泌。

2.3 铵盐对M.purpureus Y20生物量的影响

图3　不同铵盐及其浓度对M.purpurreeuuss　Y20生物量的影响Fig.3 Effect of ammonium salt type and concentration on biomass of M.purpureus Y20

由图3可知，相比于对照组，添加NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl的实验组发酵后生物量均有所提高，且3个实验组之间生物量差别不大，结合图1、2分析，表明这3 种铵盐提供的氮源和低pH值的环境有利于M.purpureus Y20的生长，Said等[22]在研究红曲色素代谢调控时也得到相似结论。添加CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3的实验组较对照组，生物量明显偏少，结合图1、2分析，表明较高pH值环境不利于紫色红曲霉生长、代谢，导致菌体生物量偏低。

2.4铵盐对红曲色素合成代谢的影响

2.4.1铵盐对红曲黄色素合成代谢的影响

图4　不同铵盐及其浓度对红曲黄色素合成代谢的影响Fig.4 Effect of ammonium salt type and concentration on yellow pigment biosynthesis

由图4可知，分别含有0.3、0.1、0.3 mol/L NH4＋的(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3发酵液较对照组相比，红曲黄色素产量差异显著（P＜0.05），分别提高了33.1%、24.1%、31.0%，表明该浓度的这3 种铵盐对红曲黄色素生物合成有促进作用，可能是因为铵盐作为氮源被菌体利用时，降低发酵液的pH值有利于红曲黄色素的生物合成，Yongsmith等[23]也有相似结论。添加相同NH4＋浓度的CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3发酵液红曲黄色素色价均低于50 U，明显低于对照组及其他3 种铵盐量实验组，结合图2、3分析，较高pH值环境（发酵过程中维持pH＞6）抑制M.purpureus Y20菌体生长，进而影响了红曲黄色素的生物合成。

2.4.2铵盐对红曲红色素合成代谢的影响

图5　不同铵盐及其浓度对红曲红色素合成代谢的影响Fig.5 Effect of ammonium salt type and concentration on red pigment biosynthesis

由图5可知，含有0.1～0.4 mol/L NH4＋的NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3实验组的红曲红色素产量均较未添加铵盐对照组有一定降低，表明铵盐对M.purpureus Y20的红曲红色素生物合成存在一定抑制作用，其中含有0.3、0.1、0.3 mol/L NH4＋的(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3发酵液红曲色素产量分别降低了9.5%、8.5%和11.6%，可能是因为铵盐作为氮源被菌体利用时，降低发酵液的pH值不利于红曲红色素的生物合成，Zhou Bo等[24]也有相似结论。添加相同NH4＋浓度CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3的发酵液红曲红色素色价均低于50 U，明显低于对照组的378 U，可能是较高pH值环境抑制M.purpureus Y20生长，也影响红曲红色素的生物合成。

2.5铵盐对桔霉素合成代谢的影响

按照1.3.4节的检测条件，对各实验组发酵液中桔霉素含量进行HPLC分析。由图6a可知，对照组桔霉素生成量随着发酵时间延长逐渐增加，发酵第8天达到0.44 mg/L；含有0.1～0.4 mol/L NH4＋的(NH4)2SO4发酵液，其桔霉素含量第4天或第5天达到峰值，之后逐渐下降；其中含有0.3 mol/L NH4＋的(NH4)2SO4发酵液在第4天达到峰值0.17 mg/L，第8天时桔霉素质量浓度降为0.05 mg/L，该产量较对照组降低了88.6%，也明显低于Zhou Bo等[24]报道的桔霉素质量浓度为0.81 mg/L。由图6b可知，含有0.1～0.4 mol/L NH4＋的NH4Cl实验组桔霉素含量在第5天达到最大值，第8天检测结果均不超过0.05 mg/L。由图6c可知，含有0.1、0.2 mol/L NH4＋的NH4NO3实验组桔霉素也呈先升高后降低趋势；含有0.3 mol/L NH4＋的NH4NO3发酵液第5天后未检出桔霉素，红曲黄色素产量较对照组提高31.0%（图4）。这可能是铵盐作为氮源被消耗时，降低了发酵液pH值，使发酵体系处于pH＜3的酸性环境中，影响相关代谢酶活性，抑制桔霉素生成代谢或加速其作为中间代谢产物的分解，Shi Kan等[25]也有相似结论。

图6　不同NNHH4＋浓度的((NNHH4)2SSOO4（aa）　、NNHH4Cl（bb　）、NNHH4NNOO3（cc）发酵液对桔霉素合成代谢的影响Fig.6 Effect of(NH4)2SO4(a),NH4Cl(b),NH4NO3(c)with different NH＋4concentrations contained in culture medium on citrinin biosynthesis

含有NH4＋0.1～0.4 mol/L的CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3发酵液连续8 d均无桔霉素检出（未图示），同时该条件下的生物量很小，原因可能是这3 种铵盐维持发酵液的较高pH值环境，抑制M.purpureus Y20的生长，影响桔霉素代谢生成。

3　结 论

添加铵盐改良M.purpureus Y20液态发酵培养基组分，研究铵盐对红曲色素、桔霉素合成代谢的影响。与未添加铵盐对照组相比，添加NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl实验组的菌体生物量、红曲黄色素产量均有所提高；红曲红色素、桔霉素产量均有所降低。含有0.3 mol/L NH4＋的(NH4)2SO4发酵液桔霉素质量浓度降为0.05 mg/L，较对照组降低88.6%，红曲黄色素升高33.1%，红曲红色素降低9.5%；含有0.1 mol/L NH4＋的NH4Cl发酵液桔霉素质量浓度降为0.05 mg/L，红曲黄色素升高24.1%，红曲红色素降低8.5%；含有0.3 mol/L NH4＋的NH4NO3发酵液红曲黄色素升高31.0%，红曲红色素降低11.6%，未检出桔霉素。说明这3 种铵盐提供的低pH值环境有利于M.purpureus Y20生长，促进红曲黄色素生物合成，抑制桔霉素、红曲红色素的生成。含有NH4＋0.1～0.4 mol/L的CH3COONH4、NH4H2PO4、C6H5O7(NH4)3发酵液均无桔霉素检出，但菌体生物量较小，色价均低于50 U，说明这3 种铵盐抑制了M.purpureus Y20的生长，从而影响红曲色素和桔霉素的代谢生成。上述结果推测：添加铵盐影响发酵液pH值环境，可通过抑制桔霉素生成、改变红曲色素合成代谢等方面调控M.purpureus Y20的营养物质吸收和代谢；添加适量NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl有利于提高红曲黄色素的生物合成，抑制桔霉素的生成。研究结果为从代谢层面研究铵盐对红曲色素和桔霉素的调控机理提供了思路和技术数据。

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Effect of Addition of Ammonium Salts to Culture Medium on the Biosynthesis and Metabolism of Pigments and Citrinin in Monascus purpureus

YUE Jianming1,YANG Qiang1,XIAO Xiao1,YIN Sheng1,ZHANG Chan1,WANG Chengtao1,*,HU Jimei2,ZHAO Jixing3
(1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 2.China International Engineering Consulting Corporation,Beijing 100048,China; 3.Shandong Zhonghui Biotechnology Co.Ltd.,Binzhou 251706,China)

Abstract:The effects of adding different kinds of ammonium salts to the culture medium on the biosynthesis and metabolism of pigments and citrinin in M.purpureus Y20 during liquid-state fermentation were studied by examining changes in the contents of monascus red pigment,monascus yellow pigment and citrinin.Also,we elaborated the underlying causes for the changes.The results showed that pH values of the fermentation broth of M.purpureus Y20 without added ammonium salt remained stable at 4.8 during fermentation,while those obtained with the addition of CH3COONH4,NH4H2PO4or C6H5O7(NH4)3were maintained at greater than 6.The initial pH of the culture medium with the addition of NH4NO3,(NH4)2SO4or NH4Cl was below 5.5,and then decreased to around 2.5 during fermentation.The final citrinin content of the groups with 0.15 mol/L(NH4)2SO4and 0.1-0.3 mol/L NH4Cl,respectively,during fermentation dropped to 0.05 mg/L,indicating an 88.6% reduction when compared with the controlgroupwith no added ammonium salt.No citrinin was detected in the fermentation broth with 0.3 mol/L NH4NO3added,and a 31.0% increase of yellow pigment content and an 11.6% decrease of red pigment content were observed compared with the control group.Similarly,no citrinin was detected in the fermentation broth with the addition of CH3COONH4,NH4H2PO4,or C6H5O7(NH4)3,but color value and biomass were lower,suggesting that the addition of ammonium salts could affect the pH environment of the fermentation,book=103,ebook=110and plays an importantrole in reducing citrinin and changing the proportions of monascuspigments.The addition of NH4NO3,NH4Cl and(NH4)2SO4can contribute to the biosynthesis of monascus yellow pigment and the inhibition of citrinin.

Key words:Monascus purpureus; monascus red pigment; monascus yellow pigment; citrinin; ammonium salts

中图分类号：TS26

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2016）05-0102-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605019 10.7506/spkx1002-6630-201605019.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：王成涛（1969—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：wct5566@163.com

作者简介：岳建明（1991—），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：970084896@qq.com

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31301411；31401669）；北京市科技计划项目（Z151100001215008）；北京市属高校创新能力提升计划项目（014213201 6）；2015年北京工商大学研究生科研能力提升计划项目

收稿日期：2015-08-13