Hedgehog信号通路抑制剂对肝内胆管癌RBE细胞生物学行为的影响*

张　杨，　徐　菁△，　张翠明，　张　玲，　乔爱秀

(山西医科大学 1病理教研室， 2第二医院超声诊断科，山西 太原 030001)



Hedgehog信号通路抑制剂对肝内胆管癌RBE细胞生物学行为的影响*

张杨1，徐菁1△，张翠明2，张玲1，乔爱秀1

(山西医科大学1病理教研室，2第二医院超声诊断科，山西 太原 030001)

[摘要]目的： 研究Hedgehog(Hh)信号通路特异性抑制剂环杷明(cyclopamine)对人肝内胆管癌细胞株RBE生物学行为的影响。方法: 用台盼蓝染色计数法和MTT比色法检测环杷明对RBE细胞增殖的影响；流式细胞术检测凋亡率，Transwell检测环杷明处理前后RBE细胞侵袭能力的变化，Western blot检测环杷明处理前后RBE细胞中Gli1和MMP-9的蛋白表达变化。 结果: 环杷明对RBE细胞株增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性。环杷明作用细胞24 h、48 h、72 h后，RBE细胞凋亡率逐渐升高，明显高于对照组的凋亡率。Transwell检测对照组穿透细胞数为154.52±13.61，而实验组穿透数为62.00±12.17，侵袭能力明显下降(P<0.01)。Gli1和MMP-9蛋白均在RBE细胞中表达，环杷明下调RBE细胞的Gli1和MMP-9表达。结论: 阻断Hh信号通路能抑制RBE细胞的增殖，促进其凋亡，并抑制其侵袭能力。

[关键词]Hedgehog信号通路； 胆内胆管细胞癌； 环杷明

肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是一种来源于肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其具有发生隐匿、发展迅速、恶性度高、临床预后差等特点[1]。近年来其发病率有逐年升高的趋势，虽然传统的治疗方法取得了较大进展，但是患者的预后并无明显改善。因此，从基因水平充分了解胆管细胞癌发生发展的作用机制，鉴定明确的靶标基因，这对胆管细胞癌进行早期诊断、预防和临床靶向治疗具有十分重要的意义。

我们前期实验通过采用人全基因组表达谱芯片和RT-PCR技术发现Hedgehog(Hh)信号通路在ICC细胞株RBE中呈高度激活状态[2]，说明Hh信号通路的异常活化与肝内肿瘤的发生密切相关。Hh信号通路主要由配体Sonic hedgehog (Shh) 、膜受体Patched (Ptch)、信号开关蛋白Smoothened(Smo)及下游的转录因子Gli组成[3]。正常表达的Hh信号在器官发育和器官修复再生过程中起着重要作用[4]，但持续异常激活的Hh信号可导致多种肿瘤的发生。在前期研究的基础上，本实验通利用Hh下游分子Smo的特异性阻断剂——环杷明(cyclopa-mine)，抑制Hh信号通路的活性，进而观察其对胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学行为的影响，旨在为胆管癌的临床诊断、治疗以及预后提供依据。

材料和方法

1材料与试剂

人肝内胆管癌细胞系RBE细胞由中国科学院上海细胞库提供；环杷明购自Selleckchem；RPMI-1640培养基购自HyClone；优质胎牛血清购自Transgen biotech；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物技术公司；Transwell培养板购自Corning；Matrigel基质胶购自BD；Gli-1单克隆抗体为Santa Cruz产品；基质金属蛋白酶 9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)单克隆抗体为Abcam产品。

2实验方法

2.1细胞培养将RBE细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

2.2细胞计数法检测环杷明对RBE细胞增殖的影响收集对数生长期细胞按1×104/cm2接种于6孔板，待细胞生长至70%～80%融合时加入不同浓度(5、10、15、20、40 μmol/L)环杷明。处理细胞24 h后胰酶消化各孔细胞并用台盼蓝染色计数。活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。方法同上，选取20 μmol/L环杷明作用于RBE细胞，分别培养24 h、48 h、72 h后进行台盼蓝计数，计算活细胞率。

2.3MTT法检测环杷明对RBE细胞活力的影响胰酶消化对数期细胞制成 5×107/L细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL。实验组分别加入5、10、15、20、40 μmol/L浓度的环杷明(无水乙醇稀释)，阴性对照组不加环杷明，每种浓度均设5个复孔；空白对照组仅加入等体积培养液。作用24 h后，每孔加入MTT (5 g/L)10 μL继续培养4 h。吸弃孔内液体，每孔加入150 μL的DMSO，室温振荡10 min。酶标仪490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值，抑制率(%)=[1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100%。方法同上，选取20 μmol/L环杷明作用于RBE细胞，分别培养24 h、48 h、72 h后进行MTT法检测，计算抑制率。

2.4Annexin V-FITC/PI双染法检测环杷明对RBE细胞凋亡的影响待培养瓶中RBE细胞贴壁生长后，分别加入含有20 μmol/L环杷明的培养基培养24 h、48 h、72 h，依照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪检测。

2.5Transwell侵袭小室法检测环杷明对RBE细胞体外侵袭能力的影响胰酶消化对数期细胞制成悬液，设置不加药对照组，实验组用含5 μmol/L环杷明的无血清培养基调整细胞浓度为5×108/L，8 μm孔径的聚碳酸酯膜用Matrigel胶进行包被，具体方法按参考文献[5]操作，在400倍显微镜下随机5个视野观察细胞，记数，结果求平均数。

2.6Western blot法检测环杷明对RBE细胞Gli1蛋白及MMP-9蛋白表达的影响将RBE细胞分别用5 μmol/L的环杷明处理24 h、48 h后收集细胞，依照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行操作，提取总蛋白并测其浓度。20%聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，添加Gli1和MMP-9的 I 抗过夜，洗膜，加入相应辣根过氧化物酶标记的II抗，室温下结合2 h，ECL显影，扫描胶片并分析。

3统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料均以均数±标准差(mean±SD)表示，用t检验及单因素方差分析比较组间差异，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

1环杷明对RBE细胞增殖和活力的影响

RBE细胞经环杷明作用后，在相差倒置显微镜下观察发现其生长减慢、细胞变小变圆、细胞间连接减少或消失、部分细胞皱缩、核固缩现象明显、出现较多悬浮的单个细胞，且浓度越高、时间越长这种变化越明显。台盼蓝计数及MTT检测不同浓度的环杷明调控Hh信号转导通路对RBE细胞的影响，浓度在5～40 μmol/L有明显的抑制作用,显示一定的浓度依赖性(图1)，与对照组相比差异有统计学显著性(P<0.01)。选取20 μmol/L浓度环杷明作用于细胞，可以发现随着环杷明作用于RBE细胞时间的延长，细胞的生长能力有明显下降(图2)，与对照组相比差异有统计学显著性(P<0.01)。由此可见，在一定范围内随着浓度的增高和作用时间的延长，环杷明对胆管癌细胞增殖的抑制作用越明显。

Figure 1.The effects of cyclopamine at different concentrations on the proliferation (A； cell counting) and the inhibition of viability (B； MTT assay) of RBE cells after 24 h. Mean±SD.n=5.**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1不同浓度环杷明对RBE细胞增殖和活力的影响

2环杷明对RBE细胞凋亡的影响

环杷明可以明显促进RBE细胞的凋亡，且随着作用时间的增加，凋亡率也逐渐增加。环靶明作用于RBE细胞24 h、48 h、72 h后，细胞凋亡率分别为(30.61±1.54)%、(47.62±2.07)% 和(63.39±2.48)%，与对照组相比，各组间差异有统计学显著性(P<0.05)，见图3。

3环杷明对RBE细胞侵袭能力的影响

5 μmol/L环杷明处理的RBE细胞侵袭能力明显减弱。环杷明处理组每400倍视野计数RBE细胞的穿透数为62.00±12.17，而阴性对照组的穿透数为154.52±13.61，2组相比差异有统计学显著性(P<0.01)，见图4。

Figure 2.The effects of cyclopamine for different time on the proliferation (A； cell counting) and the inhibition of viability (B； MTT assay) of RBE cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01vs0 h group.

图220 μmol/L环杷明作用不同时间对RBE细胞增殖和活力的影响

4环杷明对RBE细胞Gli1蛋白及MMP-9蛋白表达的影响

Western blot实验结果用软件Alpha View经灰度值分析后显示，肝内胆管癌细胞株RBE存在Gli1和MMP-9的蛋白高表达。环杷明处理后，Gli1和MMP-9的蛋白表达有下调趋势(P<0.05)，且随着时间的增加表达降低，见图5。

讨论

肝内胆管细胞癌是仅次于肝细胞癌的肝脏第2大恶性肿瘤，起源于肝内胆管上皮细胞。其传统手术治疗复发率高，预后差[1]。随着ICC发病率的提高，对其进行早期诊断和治疗已十分重要。已有研究发现Wnt/β-catenin、TGF-β、Notch和Hh信号通路促进肿瘤的发生，并且这些通路可以作为肿瘤治疗的分子靶点[6]。我们前期实验[2]已经证实Hh信号通路的异常活化与肝内肿瘤的发生密切相关，因此，对其靶向性阻断有可能成为治疗ICC的新手段。

Figure 3.The effects of cyclopamine on cell apoptosis of RBE. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h group;#P<0.05vs24 h group;△P<0.05vs48 h group.

图320 μmol/L环杷明对RBE细胞凋亡的影响

高度保守的Hh信号通路在早期器官发育和成人组织维护及修复功能中起着重要的作用。通过Hh配体和受体Patched1结合，激活Hh信号通路，解除对Smo的抑制作用，Smo激活Gli，Gli转运至细胞核，最终激活目的靶基因的转录，调节染色体形成、细胞周期活动、细胞运动和凋亡[7-8]。研究发现，许多肿瘤都与Hh信号通路的异常激活有关，如结肠癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌[9]。特异性阻断剂环杷明可以抑制由Hh信号引起的细胞反应。目前，关于Hh信号通路在ICC发生发展中的作用及环杷明对肝内胆管癌细胞生物学行为影响作用的文献报道甚少。本实验以肝内胆管癌细胞系RBE为研究对象，通过观察环杷明对肝内胆管癌细胞生物学行为的影响，为ICC的临床诊断、治疗及预后提供依据。

Figure 4.The effects of cyclopamine on invasion ability of RBE cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vswithout cyclopamine.

图4环杷明对RBE细胞侵袭能力的影响

本实验发现环杷明可以抑制RBE细胞Hh信号通路的激活。既往研究证实环杷明是一种对Hh通路有效的药物，它主要通过对抗Hh下游分子Smo而抑制Hh信号通路的活性，但并不是一种全身性的化疗药物，对机体的其它部位不会产生副作用[10]。而Gli1是Hh信号通路Smo下游的一个重要因子，起着承上启下的关键性调控作用[11]。通过Western blot检测发现经过环杷明处理的RBE细胞Gli1的表达显著降低，抑制了Hh信号通路的激活，与既往研究结果一致。

本实验观察到，环杷明处理后，RBE细胞变小变圆、生长缓慢、细胞间连接减少或消失、部分细胞皱缩、核固缩现象明显、出现较多悬浮的单个细胞，且浓度越高这种变化越明显。MTT检测结果显示其能显著抑制RBE细胞的增殖，且呈剂量和时间依赖性；凋亡检测结果显示其促进RBE细胞凋亡，且随着作用时间的延长，凋亡增加明显。上述结果提示，Hh信号分子对RBE细胞的增殖起维持作用，阻断该信号通路可以抑制胆管癌细胞RBE的生长与增殖，并促进细胞凋亡。Thayer等[12]和Berman等[13]在胰腺癌和胃癌细胞株等消化道肿瘤中也得出了相似的结论，上述研究表明用环杷明处理癌细胞,可能会导致癌细胞增殖降低，凋亡增加。其可能的机制为环杷明通过对抗Smo而抑制了其下游的Gli，使得PDGFRα和Bcl-2表达下调；Fas和DR5表达上调，而Fas和DR5有凋亡诱导活性，Bcl-2则可通过多种途径抑制凋亡[14]。其抑制增殖的作用可能与其促进细胞凋亡有关。

Figure 5.The effects of cyclopamine for different time on Gli1 and MMP-9 protein expression in RBE cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05vs24 h group.

图5环杷明对RBE细胞Gli1蛋白及MMP-9蛋白表达的影响

基膜和细胞外基质是肿瘤转移的屏障，因此MMPs对它们的降解在肿瘤的侵袭转移中起着重要作用。MMP-9属明胶酶类, 是能够降解IV型胶原的主要基质水解酶，参与体内肿瘤的转移，其表达增加与肿瘤侵袭、转移有关[15]。本实验Western blot检测发现经过环杷明处理的RBE细胞MMP-9的表达显著降低，说明环杷明可能通过抑制MMP-9的表达而使RBE细胞的侵袭和迁移能力降低。Transwell实验也得出了相同的结论。上述结果提示，通过特异性阻断Hh信号通路，可以抑制胆管癌细胞的侵袭、转移。

总之，Hh信号通路的活性与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关。在ICC中Hh信号通路异常激活，通过特异性抑制Hh信号传递可以达到分子靶向治疗ICC的目的。2012年1月，GDC-0449(Smo合成抑制剂)被FDA批准用于治疗晚期基底细胞癌[16]，而环杷明作为Hh信号通路抑制剂靶向Smo，可能成为一种新的化疗药物。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

Effect of Hedgehog signaling pathway inhibitor on biological behavior of intrahepatic cholangiocarcinoma cell line RBE

ZHANG Yang1, XU Jing1, ZHANG Cui-ming2, ZHANG Ling1, QIAO Ai-xiu1

(1DepartmentofPathology，2DepartmentofUltrasound，ThesecondAffiliatedHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001，China.Email:xuj766@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of cyclopamine, a Hedgehog (Hh) signaling pathway inhibitor, on the biological behavior of intrahepatic cholangiocarcinoma cell line RBE. METHODS: The proliferation of RBE cells was detected by cell counting with Typan blue staining and MTT assay, and the apoptosis was analyzed by the flow cytometry. The Transwell invasive cabin assay was used to detect the invasion ability, and Western blot was used to determine the protein expression of Gli1 and MMP-9 in the RBE cells before and after cyclopamine treatment. RESULTS: Cyclopamine inhibited the growth of RBE cells in a time- and dose-dependent manner. After cyclopamine treatment for 24 h, 48 h and 72 h, the apoptotic rates were significantly higher than those in control group. In control group, the number of cells invading through the Matrigel of invasion chamber was 154.52±13.61, while in experimental group it was 62.00±12.17, indicating that the invasion ability of the cells declined significantly. Furthermore, Western blot showed that the protein levels of Glil and MMP-9 in the RBE cells were decreased after treatment with cyclopamine for 24 h and 48 h. CONCLUSION: Blockage of the Hh signaling pathway with cyclopamine suppresses the proliferation, promotes the apoptosis and inhibits the invasion ability of RBE cells.

[KEY WORDS]Hedgehog signaling pathway; Intrahepatic cholangiocarcinoma; Cyclopamine

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.026

[中图分类号]R730.23

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 0351-4135642； E-mail: xuj766@163.com

*[基金项目]山西省回国留学人员科研项目(No.2011-046)；山西省留学回国人员科技活动择优资助项目(No.2011-762)；山西医科大学基础医学院331基础医学科技培植基金计划项目(No.201407)；山西医科大学校创新基金(No.01201302)

[收稿日期]2015- 10- 29[修回日期] 2016- 01- 08

[文章编号]1000- 4718(2016)03- 0544- 05

杂志网址： http://www.cjpp.net