促吞噬肽(Tuftsin)在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中的神经功能改善作用①

贾　娜　武俏丽　纪　勇　徐小林

(天津医科大学，天津300070)



促吞噬肽(Tuftsin)在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中的神经功能改善作用①

贾娜武俏丽②纪勇②徐小林②

(天津医科大学，天津300070)

[摘要]目的：探索促吞噬肽(Tuftsin)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型中的神经功能改善作用。方法：用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)免疫C57BL/6小鼠，应用微量注射泵皮下缓慢注射500 μmol/L Tuftsin。每天对各组小鼠进行神经功能评分，免疫后28 d处死各组小鼠并取其脑和脊髓组织，观察并比较各组炎性细胞浸润部位及程度、有无脱髓鞘及脱失程度，以及比较各组 IL-10和TNF-α的表达情况。结果：①Tuftsin干预组小鼠发病率比EAE模型组低，平均神经功能评分小于EAE模型组(P<0.05)。②Tuftsin干预组较EAE模型组炎性细胞的浸润程度和髓鞘的脱失程度及范围减轻(P<0.05)。③Tuftsin干预组的IL-10的表达量比EAE模型组高(P<0.05)，TNF-α的表达比EAE模型组低。结论：Tuftsin通过降低炎性反应、增强抗炎作用在中枢神经系统中发挥保护功能，降低EAE模型小鼠的炎性细胞浸润及脱髓鞘程度，减缓EAE小鼠的症状、促进其神经功能的恢复。

[关键词]多发性硬化;实验性自身免疫性脑脊髓炎;促吞噬肽

多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是中枢神经系统(Central nervous system,CNS)最常见的慢性炎症性脱髓鞘疾病，由于免疫系统攻击髓鞘导致轴索及神经元的退行性病变。其病理特征是血管周围炎性病变、髓鞘破坏、星型细胞增殖、少突胶质细胞和轴索缺失。目前多发性硬化的机制尚未完全明了，在一项关于EAE和MS最新研究动向的综述中提出，EAE是由Th1细胞免疫介导的器官特异性自身免疫病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是由CD4+T 淋巴细胞介导，导致中枢神经系统白质脱髓鞘改变的自身免疫性疾病，是MS的理想动物模型[1]。

Tuftsin[2]是一种天然的促吞噬肽，由苏-赖-脯-精(Thr-Lys-Pro-Arg)四种氨基酸组成。1970年Najjar和Nishioka[2]首次描述了其特点，Tuftsin能够促进单核细胞来源的细胞的吞噬活性，如中性粒细胞、巨噬细胞、小胶质细胞等，作用机制与这些细胞表面存在Tuftsin受体有关，同时Tuftsin还具有抗炎、抗肿瘤等作用[3-5]。国外有实验证明，Tuftsin及其类似物可以通过化学合成的方法获得，并广泛的应用于临床研究[6]。既往有研究通过体内及体外实验得出Tuftsin可以促进T淋巴细胞的活性。而T淋巴细胞介导的免疫反应在过去被认为在EAE小鼠神经元和轴索退行性病变的过程中起到关键作用[7]。

因此研究Tuftsin在EAE小鼠中可能发挥的作用可以为MS的临床实验研究提供一种新的治疗靶点及策略。国外有少量该方面的报道，证实Tuftsin通过改变T淋巴细胞或单核细胞的免疫表型，从而对中枢神经系统发挥保护作用。但是具体的机制目前还未完全明确，且目前国内尚未有相关的研究。本研究通过微量注射泵将Tuftsin缓慢注射于EAE小鼠皮下，着重观察及比较其与EAE模型组的临床神经功能评分及组织病理染色结果。

1材料与方法

1.1材料8～10周，体重约20 g的雌性C57BL/6小鼠共30只，购自北京华阜康生物技术有限公司。30只C57BL/6小鼠共分为3组，即正常对照组、EAE模型组、Tuftsin干预组。鼠源MOG35-55多肽及Tuftsin由南京金斯瑞基因技术公司合成，纯度≥98%。弗氏完全佐剂(CFA)购自美国Sigma公司；灭活结核菌素杆菌(TB)购自美国Difco公司；百日咳毒素(PTX)购自美国List Biological Laboratories公司。提取总RNA试剂盒购自美国OMEGA公司，反转录试剂盒购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购自美国Roche公司。

1.2方法

1.2.1EAE模型的建立及分组EAE组以200 μg MOG35-55溶入200 μl PBS缓冲液，再与200 μl CFA充分混合成乳剂(灭活结核菌素杆菌终浓度为5 mg/ml)，正常对照组则直接将200 μl PBS与200 μl CFA充分混合。200 μg乳剂于小鼠背部分两点皮下注射。分别于免疫后0 h及48 h腹腔注射500 ng PTX。 EAE模型建立后第1天用微量注射泵将500 μmol/L Tuftsin 20 μl缓慢注射于小鼠背部皮下，连续10 d，共200 μl[8]，制成Tuftsin干预组。

1.2.2各组实验小鼠神经功能评分免疫后每天对各组实验小鼠进行神经功能评分，连续观察28 d。神经功能评分按以下标准进行[9]：0分为无症状；1分为尾巴张力下降(完全无力，尾巴尖端不能卷曲)或后肢无力(步态不稳)；2分为尾部和后肢无力；3分为后肢瘫痪(单侧或双侧后肢一定程度上可以运动)；4分为后肢完全瘫痪(后肢完全不能运动或前肢拖动后肢运动)；5分为死亡。

1.2.3组织病理学观察各组取4只实验组小鼠在免疫后第28天采用心脏灌注法处死，4%多聚甲醛灌注后，快速取出脊髓组织，放入4%多聚甲醛中固定。脊髓组织用石蜡包埋连续切片，切片厚度为5 μm，脊髓颈及腰段取横切面分别进行苏木素-伊红染色、快蓝染色，在光学显微镜下观察脊髓组织的形态、炎性细胞浸润部位及程度、髓鞘脱失的情况。

1.2.4实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)应用RT-PCR法定量测定各组小鼠脑组织内IL-10 及TNF-α的表达情况。各组取6只实验小鼠在免疫后第28天分别处死，迅速取出各组脑组织放入液氮中灭活RNA酶。采用OMAGA总RNA提取试剂盒按说明书操作从各组脑组织中提取总RNA；采用Invitrogen反转录试剂盒按说明书操作将其逆转录为cDNA。使用Roche的定量试剂盒进行定量检测。定量过程中条件为：95℃反应5 min；变性、扩增和延伸分别为95℃反应 20 s，62℃(IL-10)或60℃(TNF-α)反应20 s，72℃反应20 s，共50个循环。72℃反应5 min。使用GAPDH作为内参校正。所用引物为：GAPDH、TNF-α、IL-10，均为小鼠来源。引物序列为：GAPDH:Forward：5′-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′，Reverse：5′-GGCATGGACTGTGGT-CATGA-3′；TNF-α：Forward：5′-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3′，Reverse：5′-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3′；IL-10：Forward：5′-TGGCCACACTTGAGAGCTGC-3′，Reverse：5′-TTCAGGGATGAAGCGGCTGG-3′。

2结果

2.1发病情况通过观察发现：正常对照组的实验小鼠均未发病，EAE模型组发病率为100%，Tuftsin干预组发病率为60%，各组死亡率均为0%，采用Fisher精确检验比较三组发病率，正常对照组与EAE模型组及Tuftsin干预组比较均有显著差异，差异具有显著统计学意义(P<0.05)；EAE模型组发病率与Tuftsin干预组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。统计两组发病小鼠的起病时间：EAE模型组平均起病时间为(17.5±1.67)d，Tuftsin干预组小鼠为(14.6±1.29)d，两组比较差异有显著统计学意义(P<0.05)。比较两组发病小鼠的平均神经功能评分，EAE模型组发病小鼠的平均神经功能评分为(2.00±0.71)分，Tuftsin干预组为(0.80±0.44)分，Tuftsin干预组发病小鼠的平均神经功能评分低于EAE模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。各组患病小鼠表现特点为：精神萎靡，毛色暗淡，尾巴张力消失，体重下降，后肢瘫痪，个别小鼠表现为步态不稳。各组实验小鼠发病情况见表1。

2.2组织病理染色结果

2.2.1苏木素-伊红染色(HE染色)光学显微镜下观察各组脊髓组织的HE染色，正常对照组脊髓HE染色结构清晰，未见炎性细胞浸润；EAE模型组脊髓组织的HE染色显示组织结构疏松，在白质区内可见不同程度的炎性细胞浸润，在小血管旁偶可见到淋巴细胞、单核细胞环绕，偶尔可见到小胶质细胞、巨噬细胞，亦可见到神经元的变性；Tuftsin干预组脊髓组织内可见到类似EAE模型组的改变，但炎性细胞浸润的程度及范围较EAE模型组有不同程度的减少。见图2。

2.2.2髓鞘染色(Luxol fast blue染色,LFB)正常对照组脊髓组织LFB染色未见到髓鞘脱失；EAE模型组脊髓组织LFB染色可见到白质疏松，片状的髓鞘脱失、不连续，有的呈空泡样改变；LFB染色在Tuftsin干预组脊髓组织内亦可见到白质疏松，髓鞘淡染、不连续及脱失；Tuftsin干预组髓鞘脱失的程度及范围小于EAE模型组，见图2。

NamenIncidencerate(%)NeurologicalscoresTimeofonset(d)Controlgroup1000.00±0.000.00±0.00EAEgroup101001)2.00±0.711)17.5±1.671)Tuftsingroup10601)2)0.80±0.441)2)14.6±1.291)2)

Note：Comparison with Control group，1)P<0.05;Comparison with EAE group，2)P<0.05.

图1　各组实验小鼠在不同时间点的平均神经功能评分Fig.1　Neurological scores of each group at different stage after immunization

2.3实时定量PCR结果

2.3.1IL-10的表达变化使用RT-PCR法测得各组小鼠脑组织的TNF-α和IL-10在免疫后第28天的表达含量见表2、图3，可以看出；正常对照组小鼠的脑组织内也有少量IL-10和TNF-α的表达。EAE模型组小鼠IL-10在免疫后第28天的表达量与正常对照组相比表达增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。Tuftsin干预组小鼠脑组织内IL-10的表达在免疫后第28天与EAE模型组相比明显升高且具有统计学意义(P<0.05)，其升高幅度为2.97倍。

图2　各组实验小鼠在免疫后第28天的HE染色和LFB染色(×200)Fig.2　HE stain and LFB stain of each group at 28th days after immunization(×200)

NamenIL-10TNF-αControlgroup60.0052±0.00130.0091±0.0039EAEgroup60.0288±0.00901)0.0354±0.01271)Tuftsingroup60.0702±0.01611)2)0.0152±0.00592)

Note：Comparison with Control group，1)P<0.05；Comparison with EAE group,2)P<0.05.

图3　各组实验小鼠脑组织内IL-10 及TNF-α的表达Fig.3　mRNA expression of IL-10，TNF-α by brian tissue of each group

2.3.2TNF-α的表达EAE模型组小鼠脑组织的TNF-α的表达与IL-10类似，免疫后第28天的表达与正常对照组比较差异较大，其明显高于正常对照组。Tuftsin干预组小鼠在免疫后第28天TNF-α的表达量高于正常对照组，相较于EAE模型组明显下降，下降幅度约为0.430倍，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、图3。

3讨论

国外有研究表明Tuftsin可以改善EAE小鼠的症状、促进其神经功能的恢复。我们的研究通过给EAE小鼠用微量注射泵皮下缓慢注射Tuftsin，着重于比较EAE模型组与Tuftsin干预组两组的神经功能评分和组织病理染色结果，结果发现：①Tuftsin干预组的发病率低于EAE模型组；②Tuftsin干预组的神经功能评分与EAE模型组相比明显降低且症状较轻；③组织病理染色结果显示Tuftsin干预组的炎性细胞浸润及脱髓鞘的程度较EAE模型组减轻。因此，我们推测Tuftsin可以改善EAE小鼠的临床神经功能症状及脱髓鞘的程度，这与国外相关报道结论一致。另外本研究发现Tuftsin干预组比EAE模型组的初次发病时间延迟。因此我们推测是否Tuftsin在EAE病程的早期就开始发挥作用，国内目前还未见这方面相关的报道，这也是我们进一步研究的方向。

近年来Joanna Mikita等[10]的一项研究提出：通过改变EAE模型中单核细胞M1/M2的活性模式，能够改善EAE的临床症状。Bhasin等[8]的研究同样证实Tuftsin通过激活小胶质细胞可以减轻EAE小鼠的症状，并且能够促进其神经功能的恢复。随后他们又提出Tuftsin能够促进Th1向Th2的转化从而减轻EAE的症状。本研究结果显示，免疫后28天Tuftsin干预组TNF-α的表达量比EAE模型组降低，而IL-10的表达量比EAE模型组高，推测这可能与T淋巴细胞或巨噬细胞的免疫表型发生改变有关。类似的研究也证实了这一观点，Wu等[11]通过建立EAE小鼠模型体内实验以及体外培养T细胞、小胶质细胞的研究表明Tuftsin能够下调Th1的炎性作用、上调TH2的抗炎作用以及Treg细胞的作用从而发挥作用改善EAE的症状，促进其神经功能的恢复。1995年Khoruts等[12]的研究提出Th2型反应能够抑制EAE和MS的病情发展。最近在关于炎症性肠病动物模型和狼疮肾炎动物模型的研究中也得出了同样的结论，Tuftsin-PC能够下调促炎因子 IL-1β、TNF-α和IL-17的表达，相反增加抗炎因子IL-10的表达，从而能够防止实验小鼠肠炎和狼疮肾炎的发生[13,14]。本研究也支持这种可能的机制：Tuftsin能够改变T淋巴细胞的免疫表型，通过提高Th2的抗炎作用、分泌保护性因子在中枢神经系统内发挥保护性作用，从而改善EAE小鼠的神经功能。

Tuftsin能够促进单核细胞来源的细胞吞噬活性，如中性粒细胞、巨噬细胞、小胶质细胞等，小胶质细胞是中枢神经系统重要的免疫效应细胞。激活状态下，小胶质细胞具有抗原提呈作用，在EAE的发病过程中，小胶质细胞激活免疫反应，参与疾病的发生，另外小胶质细胞还可以分泌一些有害的细胞因子参与MS的发病[15]。但是近年来有报道小胶质细胞具有双重作用，在发挥有害作用的同时也对中枢神经系统发挥保护作用[16,17]。Bhasin等[8]的研究表明Tuftsin通过激活小胶质细胞可以减轻EAE小鼠的症状，并且可以促进其神经功能的恢复。本研究结果显示：Tuftsin可以降低EAE小鼠脱髓鞘及炎性细胞浸润的程度，改善EAE小鼠的神经功能，推测可能与促进小胶质细胞活性有关。

Tuftsin的促吞噬活性作用，尤其是对小胶质细胞及巨噬细胞的作用，使它成为一种潜在的免疫治疗靶向，可以为临床治疗提供实验依据。

4结论

Tuftsin在中枢神经系统内能够发挥保护作用，降低EAE模型小鼠的炎性细胞浸润及脱髓鞘程度，减缓EAE小鼠的症状、促进其神经功能的恢复。

参考文献：

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[收稿2015-07-25修回2015-08-21]

(编辑倪鹏)

Tuftsin can attenuates symptoms in experimental autoimmune encephalo-myelitis mouse

JIANa,WUQiao-Li,JIYong,XUXiao-Lin.

TiangjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

[Abstract]Objective:To explore whether Tuftsin can attenuates symptoms in experimental autoimmune encephalomyelitis mouses.Methods: C57BL/6 mice were immunized with MOG35-55 peptides,and evaluated for clinical neurological score every day.10 mice of the EAE were injected with Tuftsin subcutaneously.The spinal cord were stained by the methods of Haematoxylin Eosinstain,Luxol Fast Blue stain.The mRNA expression of IL-10 and TNF-α from brian tissue were detected at the 28 days by RT-PC method.Results: The controlled mice had no symptoms of disease and HE,LFB were normal.Comparison EAE group with Tuftsin group of HE,LFB,EAE group were server than Tuftsin group.The expression of IL-10 in Tuftsin group was higher than EAE group.The expression of TNF-α in Tuftsin group was lower than EAE group.Conclusion: Tuftsin can attenuates symptoms in experimental autoimmune encephalomyelitis mouses.

[Key words]Multiple sclerosis；Experimental autoimmune encephalomyelitis;Tuftsin

中图分类号R744.5

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0323-05

作者简介：贾娜(1987年-)，女，在读硕士，主要从事脑血管病研究，E-mail:Xjunnana@163.com。通讯作者及指导教师：徐小林(1963年-)，男，硕士，主任医师，硕士生导师，主要从事脑血管病的基础与临床方面的研究，E-mail：hhyyxxl@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.006

①本文为天津市应用基础与前沿技术研究计划自然科学基金一般项目(M0101)。

②天津市环湖医院，天津300060。