凹叶景天总黄酮止血和耐缺氧作用研究

常 征，王 蓉，李洪潮，刘 伟，张 铁，沈清清，李付惠

（1. 文山学院 环境与资源学院，云南 文山 663099；2. 云南省高校特色植物开发利用工程研究中心，云南 文山 663099）

凹叶景天总黄酮止血和耐缺氧作用研究

常 征1,2，王 蓉1,2，李洪潮1,2，刘 伟1,2，张 铁1,2，沈清清1,2，李付惠1,2

（1. 文山学院 环境与资源学院，云南 文山 663099；2. 云南省高校特色植物开发利用工程研究中心，云南 文山 663099）

用乙醇提取方法获取凹叶景天总黄酮。采用灌胃给药的方法，给予不同剂量凹叶景天总黄酮，连续观察 14 d，检测药物对小鼠的急性毒性作用。检测不同剂量凹叶景天总黄酮对小鼠出血凝血时间及对常温常压缺氧、亚硝酸钠中毒缺氧和急性脑缺血小鼠存活时间的影响。研究表明，凹叶景天总黄酮明显缩短小鼠出血和凝血时间，延长缺氧小鼠的存活时间，凹叶景天总黄酮具有止血和耐缺氧作用。

凹叶景天；止血；耐缺氧；急性毒性；最大耐受量

凹叶景天为景天科景天属植物凹叶景天Sedum emarginatum Migo 的全草，性凉、味苦酸，归心、肝、大肠经，具有消臃肿，利湿热，利水和血，痔漏作用，可用于治蛇咬伤，疔疽，便毒，风痹，黄疸，汗斑[1]。民间常以本品鲜品捣烂以菜油浸泡外擦，治疮疖、无名肿痛，内服用于吐血、便血、月经过多等，为土家族常用植物药[2-3]。黄酮具有多种生物活性，是许多药用植物的有效成分，药理作用主要表现为抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎、镇痛和调节免疫等作用[4]。目前未见凹叶景天中黄酮的镇静催眠、止血和耐缺氧作用相关报道。本文初步探索凹叶景天总黄酮的镇静催眠、止血和耐缺氧作用，为进一步开发利用凹叶景天提供科学依据。

1 材料

1.1 实验仪器和试剂

101型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）、HH.B11.420型恒温培养箱（上海市跃进医疗器械一场）、JA2003电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、HZ—D（Ⅲ）型循环水真空泵（河南省豫华仪器有限公司）、W201D恒温水浴锅（上海申顺生物科技有限公司）、R—201旋转蒸发器（上海申顺生物科技有限公司）、单相电容运转电动机（上海申顺生物科技有限公司）。

凹叶景天购于文山市小西门中药街，经文山学院沐建华高级实验师鉴定为景天科景天属植物凹叶景天。亚硝酸钠（天津市风船化学试剂科技有限公司）、钠石灰（A型，上海五四化学试剂有限公司）。

1.2 实验动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±2 g，购于昆明医学院动物试验中心，合格证号：滇实动证第2014017号。动物按性别分笼饲养。实验期间，室温控制在22±2 ℃，湿度控制在55±5%，12 h/12 h光暗交替照明，自由进食饮水。本实验所有研究均遵循国家实验动物委员会相关规定。

2 方法

2.1 供试样品的制备

取凹叶景天全草干燥切断、粉碎，用70%乙醇在90 ℃条件下浸提2次，每次1 h，合并滤液，再用旋转蒸发仪回收乙醇，将所得浸膏用蒸馏水配制成浓度（以生药量计）为3000 mg/mL的溶液，即为凹叶景天总黄酮，置于4 ℃环境中保存备用[5]。

2.2 急性毒性试验研究

参照经典的急性毒性试验方法，进行凹叶景天醇提物的急性毒性试验[6]。

2.2.1 半数致死量试验

昆明种小鼠在实验室适应性饲养一周后随机分成4组：空白对照组、凹叶景天醇提物组（600、6000、60000 mg/kg），每组4只，雌雄各半。给药前禁食12 h，不禁水。凹叶景天醇提物组按20 mL/kg体重灌胃给药1次，空白对照组灌胃等体积的蒸馏水，进行半数致死量（LD50）值的测定。14 d内无小鼠死亡，无法计算LD50，故进行最大耐受量（MTD）实验。

2.2.2 最大耐受量实验

昆明种小鼠在实验室适应性饲养一周后随机分成2组，分别为空白对照组和凹叶景天醇提物组，每组10只，雌雄各半。凹叶景天醇提物组小鼠以生药量3000 mg/mL（最高浓度），20 mL/kg灌胃凹叶景天醇提物，24 h内给药1次；空白对照组给以等体积蒸馏水。给药后观察小鼠的行为活动，如精神状态、被毛的变化、摄食饮水是否正常、呼吸、粪便是否有异样、眼、鼻、口腔有无异常分泌物及死亡等情况，连续观察14 d，每天早晚各1次，记录累积死亡数及小鼠体重变化。死亡动物即刻进行尸检，肉眼观察其主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）的变化。

2.3 对小鼠止血凝血时间的影响

2.3.1 出血时间测定

昆明种小鼠在实验室适应性饲养7 d，随机分为5组：空白对照组（生理盐水）、云南白药组（65 mg/kg，阳性对照）、凹叶景天总黄酮343.68、171.84和85.92 mg/kg三个剂量组，每组10只，雌雄各半。空白对照组灌胃给予生理盐水；云南白药组灌胃给予云南白药溶液；凹叶景天高、中、低剂量组分别灌胃给予凹叶景天乙醇提取液，给药量为20 mL/kg，连续6 d。第6天给药1 h后，用利剪于小鼠尾尖1～3 cm处横断，待血液自然流出后计时， 每隔15 s 用滤纸吸去血滴1次， 直至血液自然停止， 记录并计算出血时间[7-8]。

2.3.2 凝血时间测定

小鼠分组及给药同2.3.1。于第6天给药1 h后，用内径为1 mm的玻璃毛细管插入小鼠内眦后静脉丛取血，血液至毛细管4～5 cm为止。每隔30 s折断毛细玻管的一小段，检查有无出现血凝丝。从毛细玻管内眦采血到血液到出现血凝丝的时间，即为凝血时间。

2.4 耐缺氧试验

2.4.1 常温常压耐缺氧实验

昆明种小鼠在实验室适应性饲养一周，随机分为4组：模型组、凹叶景天提取物343.68、171.84和85.92 mg/kg 3个剂量组，每组10只。模型组给予蒸馏水，凹叶景天高、中、低剂量组分别灌胃给予凹叶景天总黄酮，每天1次，连续灌胃14 d，灌胃量20 mL/kg。

于末次给药1 h后，将各组小鼠分别放入的250 mL磨口瓶内(每瓶1只)， 瓶内盛有10 g钠石灰以吸收二氧化碳和水，在瓶口处均匀涂上凡士林密封。观察并记录小鼠存活时间。

2.4.2 亚硝酸钠中毒耐缺氧存活实验

小鼠分组及给药同2.4.1，于末次给药1 h后，各组动物按2.5 mg/kg体重剂量腹腔逐只注射亚硝酸钠，腹腔注射体积为10 mL/kg，注射后立即用秒表记录观察动物存活时间。

2.4.3 急性脑缺血性耐缺氧实验

小鼠分组及给药同2.4.1，于末次给药1 h后，各组动物自颈部逐只用颈椎脱臼法断头，立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停止的时间[9]。

2.5 统计分析

采用统计学软件SPSS11.5进行数据的统计学分析， 结果用Mean ± SD表示。选用One-way ANOVA结合Post-Hoc（LSD法）方法进行组间差异分析。以P值小于0.05表示统计学差异显著性。

3 试验结果

3.1 最大耐受量试验

以凹叶景天总黄酮的最高混悬浓度（以生药量计）3000 mg/mL和给药量20 mL/kg进行灌胃给药1次后连续观察14 d。给药当天大部分小鼠出现自主活动减少、懒动、不活跃、有的甚至出现闭目、反应有些迟钝等现象，但无竖毛、抽搐、翻倒等异常情况，给药第2天上述症状消失恢复正常。各组小鼠体重、进食量与正常组相比，无明显差异，排便正常。试验期间无小鼠死亡。观察14 d后，小鼠脱颈椎处死，取各脏器肉眼观察，实质器官大致正常，无心肺淤血，无肝脾肿大。该试验中，最高浓度凹叶景天总黄酮无法引起小鼠死亡，因此按凹叶景天总黄酮最高浓度为昆明种小鼠的最大耐受量（MTD）(以生药量计)，即60 g/kg。

3.2 凹叶景天总黄酮对小鼠出血和凝血时间的影响

与模型组相比，中剂量和高剂量凹叶景天总黄酮及云南白药显著缩短断尾小鼠出血时间及凝血时间（P ＜ 0.05，P ＜ 0.05；P ＜ 0.01，P ＜ 0.01；P＜0.01，P ＜0.01），表明凹叶景天总黄酮具有止血作用，见表1。

表1 凹叶景天总黄酮对小鼠出血和凝血时间的影响（n=10，x±sd）

3.3 凹叶景天总黄酮对缺氧小鼠存活时间的影响

与模型组相比，中剂量和高剂量凹叶景天总黄酮均可显著延长常温常压缺氧和急性脑缺血小鼠的存活时间（P ＜ 0.01，P ＜ 0.01；P ＜ 0.01，P ＜ 0.01），各剂量凹叶景天总黄酮显著延长亚硝酸钠中毒小鼠的存活时间（P ＜ 0.05，P ＜ 0.05，P ＜ 0.05）。表明凹叶景天总黄酮具有耐缺氧作用，见表2。

表2 凹叶景天总黄酮对缺氧小鼠存活时间的影响（n=10，x±sd）

4 讨论

凹叶景天为景天科多年生草本植物，广泛分布于陕西、甘肃、河南、江苏、四川、安徽及长江以南各地区，是土家族常用植物药，称为“岩板还阳”“马牙半枝莲”[10-12]。除景天科凹叶景天有药用价值外，同科植物佛甲草也是一种药用植物，具有明显减慢或阻断心脑缺氧、缺血的病理过程，对脑缺氧和心肌缺血有改善作用[13]。

凹叶景天含有槲皮素、异鼠李素和甘草苷等黄酮类化合物，其全草各部位总黄酮含量最低的为根，最高的是花[14-16]。 黄酮类化合物是多酚大家族的成员之一，是一类植物次级代谢产物，广泛存在于人们的日常饮食中，具有抗氧化、清除自由基、抗炎镇痛、抗肿瘤、护肝和防治心血管疾病等作用[4,17-21]。陈皮黄酮类物质川陈皮素、裸花紫珠总黄酮和柿子黄酮类化合物均可显著缩短昆明种小鼠断尾出血时间，裸花紫珠总黄酮和柿子黄酮类化合物有效减短凝血试验中小鼠的凝血时间[22-24]。马齿苋乙醇提取物主要成分为黄酮类化合物和单宁，可提高缺氧小鼠体内糖酵解过程中关键酶的活性和ATP的水平，具有显著的耐缺氧作用[25]。黄酮类化合物柚皮素和槲皮素可显著下调缺氧小鼠大脑中低氧诱导因子、血管内皮生长因子、活性半胱天冬酶3和泛素的表达水平，有效缓解缺氧小鼠的脑功能损害[26]。凹叶景天总黄酮明显缩短小鼠出血和凝血时间，延长缺氧小鼠的存活时间，提示凹叶景天总黄酮具有止血和耐缺氧作用。

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Hemostasis and Anti-Hyproxic Effects of Sedum Emarginatum Migo

CHANG Zheng1,2, WANG Rong1,2, LI Hongchao1,2, LIU Wei1,2, ZHANG Tie1,2, SHENG Qianqian1,2, LI Fuhui1,2
(1. School of Environment and Resources, Wenshan University, Wenshan Yunnan 663099, China; 2. Engineering Research Center of Development and Utilization of Characteristic Plant Resources of Yunnan Universities, Wenshan Yunnan, 663099, China)

Sedum emarginatum Migo fl avonoids (SMF) are obtained with ethanol extraction method. The acute toxicity of ethanol extract from SMF on mice is explored in accordance with classical acute toxicity test methods with the continuous administration and observation for 14 days. SMF is evaluated on anti-hypoxic activity in several hypoxia mice models, including closed normobaric hypoxia, sodium nitrite toxicities and acute cerebral ischemia. The maximally tolerated dose (MTD) of SMF is 60g/kg. Given orally, the SMF could enhance the survival time of mice in both of the normobaric, chemical hypoxia and acute cerebral ischemia models. These results demonstrate that SMF possesses notable hemostasis and anti-hyproxic ability.

Sedum Emarginatum Migo; hemostasis; anti-hyproxic; the acute toxicity; the maximally tolerated dose

R284.2

A

1674-9200（2016）06-0004-04

（责任编辑 张 铁）

2016-09-20

文山学院科研基金项目“生物科学专业提升专业服务产业能力建设项目”（ZX20150102）。

常征，男，云南马关人，文山学院环境与资源学院副教授，硕士，主要从事生化与分子和药理学研究；王蓉，女，安徽芜湖人，文山学院环境与资源学院教师，硕士，主要从事中药药理研究；李洪潮，男，云南马关人，文山学院环境与资源学院副教授，主要从事微生物学研究。