绵马贯众3种间苯三酚类化合物及其抑菌活性研究

贾小舟,李细霞,袁丽鹏,尹永芹,杨雄辉,沈志滨

(1.广东药科大学 中药学院,广东 广州 510006； 2.肇庆医学高等专科学校,广东 肇庆 526020；3.国药集团德众(佛山)药业有限公司,广东 佛山 528000)



绵马贯众3种间苯三酚类化合物及其抑菌活性研究

贾小舟1,李细霞2,袁丽鹏1,尹永芹1,杨雄辉3,沈志滨1

(1.广东药科大学 中药学院,广东 广州 510006； 2.肇庆医学高等专科学校,广东 肇庆 526020；3.国药集团德众(佛山)药业有限公司,广东 佛山 528000)

目的 对绵马贯众中3种间苯三酚类成分进行研究,并考察它们对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌3种真菌的抑菌活性。方法 采用硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20凝胶柱色谱等色谱手段进行分离纯化,并通过波谱数据和理化性质对化合物进行鉴定。采用M38-A2微量稀释法,筛选单体化合物对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌3种真菌的抑菌活性,并测定最小抑菌浓度(MIC)。 结果 分离得到3个间苯三酚类化合物,分别为白绵马素AA、三环黄绵马酸ABB、黄绵马酸AB；3个化合物对红色毛癣菌的MIC分别为160、60、70 μg/mL,对犬小孢子菌的MIC分别为140、90、80 μg/mL,对须癣毛癣菌的MIC值均>160 μg/mL。结论 3个间苯三酚类化合物对3种真菌均有不同程度的抑制作用,对红色毛癣菌和犬小孢子菌的活性均优于须癣毛癣菌。

绵马贯众； 间苯三酚类化合物； 抑菌活性

绵马贯众为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨(DryopteriscrassirhizomaNakai)的干燥根茎及叶柄残基,始载于《神农本草经》,味起初淡而微涩,后渐苦、辛,性微寒,有小毒,具有清热解毒、杀菌驱虫、止血等功效[1]。绵马贯众为临床常用中药材,具有抗病毒、抗疟、抗肿瘤、抗癌、驱虫、止血、抗细菌等多种药理活性[2-3]。目前,对绵马贯众的研究主要集中在抗细菌感染、抗疟、抗肿瘤等方向,而对抑制真菌,尤其是对临床常见皮肤癣菌的抑制作用研究较少。本实验室前期研究发现,间苯三酚类化合物对浅部真菌具有明显的抑制作用,而且鳞毛蕨属植物富含间苯三酚类化合物[4],因此本文拟对绵马贯众的间苯三酚类化合物进行提取分离,并对间苯三酚类化合物对浅部真菌抑制活性进行研究。

1 仪器与材料

Varian UNITY INOVA 500型超导脉冲傅里叶变换核磁共振仪(美国Varian公司)；ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Zf20D暗箱式紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)；X-5显微熔点测定仪(河南巩义市科瑞仪器有限公司)；XYQ-SG46-280S手提式压力蒸汽灭菌锅(杭州科晓化工仪器设备有限公司)；DZF-6053电热恒温培养箱(上海东麓仪器设备有限公司)；SW-CJ-1F超净工作台(苏净集团安泰公司)。

层析硅胶(批号：0140015,青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20型凝胶(批号：081209,Pharmacia公司)；羧甲基纤维素钠(批号：101210,广东汕头市西陇化工厂)；坚牢蓝BB盐(上海远慕生物科技有限公司)；色谱甲醇、乙腈(Ocenpeak)；二甲基亚砜(DMSO,广州瑞舒生物科技有限公司)；RPMI Medium 1640粉末(批号：1256837,美国GIBICO公司)；巴氏吸管(批号：20160107,NEST Biotechnology Co.Ltd);其余试剂均为分析纯。

绵马贯众产于东北的黑龙江省,购于广州采芝林连锁药业(大学城店),经广东药科大学中药学院刘基柱副教授鉴定为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨(DryopteriscrassirhizomaNakai)的叶柄残基和干燥根茎。

供试真菌：红色毛癣菌(Trichophytonrubrum,编号：CMCC(F)T1d)；须癣毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes,编号：CMCC(F)T5c)；犬小孢子菌(Microsporumcanis,编号：CMCC(F)M3d)；近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis,编号：ATCC 22019)；以上真菌由中国医学科学院皮肤研究所(南京)提供。盐酸特比萘芬原料药(纯度>98%,济南明鑫制药股份有限公司)；氟康唑注射液(纯度99.4%,寿光富康制药有限公司,批号：A-10511211001)。

2 提取与分离

称取绵马贯众干燥药材30 kg,粉碎成粗粉状,阴凉通风干燥处保存。用10倍体积95%(体积分数)乙醇回流提取3次,时间分别为2、1.5、1 h,减压浓缩回收乙醇至无醇味得到浸膏3.0 kg。用硅胶拌样,进行硅胶柱色谱法的初步分离,依次采用不同比例的石油醚-乙酸乙酯洗脱(体积比分别为100∶0,100∶1,50∶1,20∶1,10∶1,5∶1,2∶1),TLC检测合并相同组分得A(60 g)、B(305 g)、C(380 g)、D(120 g)、E(80 g)5个组分。组分A以石油醚-乙酸乙酯洗脱(体积比100∶1～20∶1),合并相同组分,得A1、A2、A3、A4,其中A3中有白色粉末沉淀出现,经丙酮反复重结晶得化合物Y1(12 mg)。组分B以石油醚-乙酸乙酯洗脱(体积比200∶1～50∶1),合并相同组分,得B1、B2、B3,B2以环己烷-丙酮洗脱(体积比60∶1～10∶1)得化合物Y2(14 mg)。组分E以石油醚-乙酸乙酯洗脱(体积比50∶1～10∶1),合并相同组分,得E1、E2、E3、E4,E3部分经Sephadex LH-20凝胶柱层析,馏分经丙酮重结晶得化合物Y3(4 mg)。

3 结构鉴定

化合物Y1：白色不规则粉末(正己烷-丙酮),mp 166～168 ℃,甲醇和乙腈中的溶解度较差,易溶于三氯甲烷。硅胶薄层层析板展开,紫外下有吸收,喷以0.3%(质量分数,下同)坚牢蓝BB显色剂呈橙红色,喷以坚牢蓝B盐显粉红色。ES-MSm/z:403(M-H),推测分子式为C21H24O8。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ：13.01(1H,s,4,4′-OH),12.29(1H,s,6,6′-OH),3.29(2H,s,H-7),2.71(3H,s,H-9,9′),1.52(3H,brs,H-10,10′),1.47(3H,brs,H-11,11′)。13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ：203.39(8,8′-C),199.59(2,2′-C),187.82(4,4′-C),173.73(6,6′-C),110.91(1,1′-C),108.66(3,3′-C),44.72(5-C),44.67(5′-C),29.51(9-C),29.42(9′-C),25.52(10,10′-C),24.37(11,11′-C),17.40(7-C)。以上数据与文献[5-6]报道的基本一致,确定化合物Y1为白绵马素AA(Albaspidin AA)。

化合物Y2：类白色不规则结晶粉末(丙酮),mp 118～120 ℃,硅胶薄层层析板上展开,紫外灯下有吸收,喷以0.3%坚牢蓝BB显色剂,105 ℃加热呈现橘红色斑点。ES-MSm/z:626(M-H),推测分子式为C33H38O12。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ：13.28(1H,s,4-OH),13.01(1H,s,6-OH),11.58(1H,s,4′,2″-OH),10.83(1H,s,2′,6″-OH),10.22(1H,s,6,4″-OH),3.60(2H,s,H-7′),3.52(2H,s,H-7),3.19(2H,t,H-9′,8″),2.73(3H,s,H-11′,10″),2.58(3H,s,H-9),1.74(2H,m,H-10′,9″),1.52(3H,s,H-10,11),1.00(3H,t,H-11′,10″)。13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ：208.33(8′-C),208.24(7″-C),203.65(8-C),198.97(2-C),197.34(4-C),195.94(6-C),178.88(4′,2″-C),172.97(6′-C),172.11(4″-C),159.87(6″-C),159.00(2′-C),111.58(3-C),111.36(1-C),108.66(1″-C),108.49(3′-C),107.01(1′-C),106.44(5″-C),105.99(5′-C),105.89(3″-C),46.21(5-C),44.73(8″-C),44.56(9′ -C),29.56(9-C),25.44(10-C),24.41(11-C),18.14(10′,9″-C),16.74(7-C),14.32(11′-C),14.20(10″-C),7.9(7′-C),4.2(12″-C)。以上数据与文献[7-8]报道的基本一致,确定化合物Y2为三环黄绵马酸 ABB(Trisflavaspidic acid ABB)。

化合物Y3：淡黄色针状结晶(丙酮),mp 189～191 ℃,易溶于三氯甲烷,且在三氯甲烷中比较稳定。硅胶薄层层析板展开,紫外灯光下显色有紫外吸收,说明有共轭结构。喷洒0.3%坚牢蓝BB显色剂,105 ℃下呈橙红色。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ：13.02(1H,s,4-OH),11.59(1H,s,6-OH),10.83(1H,s,6′-OH),10.20(1H,s,4′-OH),10.23(1H,s,2′-OH),3.56(2H,s,H-7),3.20(3H,t,H-9′),2.73(3H,s,H-9),2.59(3H,s,H-12′),1.72(2H,m,J=7.2 Hz,H-10′),1.55(3H,s,H-10),1.43(3H,s,H-11),1.00(3H,t,H-11′)。13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ：208.37(8′-C),203.72(8-C),199.44(2′-C),198.96(2-C),188.28(4,4′-C),172.97(6′-C),172.10(6-C),111.47(3-C),108.42(1-C),107.01(5′-C),105.89(3′-C),105.56(1′-C),46.17(5-C),44.56(9′-C),31.81(7-C),29.63(9-C),25.62(10-C),24.40(11-C),18.04(10′-C),14.22(11′-C),7.72(12′-C)。以上数据与文献[9]报道的基本一致,确定化合物Y3为黄绵马酸AB(Flavaspidic acid AB)。

4 间苯三酚化合物抑菌试验

4.1 供试液的配制

三环黄绵马酸ABB、白绵马素AA和黄绵马酸AB分别用二甲基亚砜(DMSO)溶解,各配制成质量浓度为2 mg/mL的溶液。氟康唑药液质量浓度为2 mg/mL。将盐酸特比萘芬原料药用生理盐水溶解,配制成质量浓度为2 mg/mL的药液。

4.2 沙氏培养基(SDA)的配制

称取蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g置烧杯中,加入蒸馏水1 000 mL混匀,玻璃棒搅拌,微波炉加热熔化,并用1 mol/L HCl溶液调pH值至5.4±0.2,培养基分装、密封,121 ℃高压灭菌20 min,冷却后置于4 ℃冰箱备用[10]。

4.3 RPMI-1640培养基的配制

称取RPMI-1640粉末10.4 g,加蒸馏水900 mL,称取3-(N-吗啉基)丙磺酸盐粉末34.5 g,搅拌使溶解。同时用1 mol/L NaOH溶液调培养基的pH为7.0±0.1,加蒸馏水使培养基终体积为1 000 mL,0.22 μm针式滤器滤过,无菌分装至锥形瓶内,置于4 ℃冰箱内备用。

4.4 菌悬液的制备

将受试菌株红色毛癣菌等3种真菌接种于含沙氏培养基(SDA)的培养皿上,28 ℃培养4～5 d充分活化,置于组织研磨器中,加入质量浓度0.85%无菌生理盐水,均匀研磨,调整浊度至0.5麦氏浊度,并用血细胞计数板计数调整菌液浓度为1×103～3×103CFU/mL。

4.5 最低抑菌浓度(MIC)的测定

按美国CLSI制定的M38-A2方案[11]进行测定：用RPMI-1640培养基将“4.1”项下制备的间苯三酚供试液稀释为20 μg/mL,并于96孔板上的第1至第10列用RPMI-1640液体培养基进行横向倍比稀释；第11列为生长对照孔,加入RPMI-1640液体培养基100 μL；第12列为空白对照,加入RPMI-1640液体培养基200 μL。再于第1～11列各孔中加入接种菌液100 μL,此时,第1～10列单体化合物质量浓度为20～0.039 μg/mL。将96孔板置于35 ℃恒温孵育7 d,以肉眼观察,视相当于与生长对照即11列,产生了80%生长抑制的终浓度为MIC。各株菌按以上操作平行重复测定4次,计算MIC的几何均数。盐酸特比萘芬阳性组同上操作。

在每次测定的同时,平行操作条件下进行质量控制。质控(QC)株采用近平滑念珠菌(ATCC 22019),质控药物为氟康唑。QC株的MIC应在1.0～4.0 μg/mL范围内,试验结果表明均符合操作标准。见表1～表2。

表1 3种单体化合物对3种真菌的MIC值Table 1 MICs of three compounds on three fungus

表2 氟康唑对近平滑念珠菌的作用Table 2 The effect of fluconazole on Candida parapsilosis

注：“-”为不长菌； “+”为生长； 生长对照为不含单体化合物； 阴性对照为空白培养基。

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(责任编辑：陈翔)

Study on the three kinds of phloroglucinol derivatives ofDryopteriscrassirhizomaNakai and their antifungal activity

JIA Xiaozhou1,LI Xixia2,YUAN Lipeng1,YIN Yongqin1,YANG Xionghui3,SHEN Zhibin1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.DepartmentofAnatomy,ZhaoqingMedicalCollege,Zhaoqing526020,China； 3.SinopharmGroupDezhongPharmaceuticalLimitedCompany,Foshan528000,China)

Objective To study the three kinds of phloroglucinol derivatives ofDryopteriscrassirhizomaNakai,and screen for antifungal activity againstTrichophytonrubrum,TrichophytonmentagrophytesandMicrosporumcanis. Methods The phloroglucinol derivatives ofDryopteriscrassirhizomaNakai were isolated and purified by silica gel column chromatography and Sephadex LH-20 column chromatography. All the compounds were identified by spectral analyses and physiochemical properties. The antimicrobial activity of compounds againstTrichophytonrubrum,TrichophytonmentagrophytesandMicrosporumcaniswas studied by using M38-A2 microdilution method,and the minimum inhibitory concentration(MIC) was determined. Results Three compounds were isolated and identified as Albaspidin AA,Trisflavaspidic acid ABB,Flavaspidic acid AB. MIC of the three compounds againstTrichophytonrubrumwas 160,60 and 70 μg/mL,and MIC forMicrosporumcaniswas 140,90 and 80 μg/mL,and MIC forTrichophytonmentagrophyteswas all greater than 160 μg/mL. Conclusion Three compounds had different degree of inhibitory effect on the three fungus. The activity of theTrichophytonrubrumand the culture of the dog was better than that of the tinea.

DryopteriscrassirhizomaNakai; phloroglucinol derivatives; bacteriostatic activity

2016-07-20

广东省应用型科技研发扶持专项(2015B020234009)

贾小舟(1991—),女,2014级硕士研究生,Email：2630151879@qq.com；通信作者：沈志滨(1964—),女,博士,教授,主要从事中药及复方化学成分研究,Email：szb8113@126.com。

时间：2016-09-29 16:21

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160929.1621.003.html

R282.2

A

1006-8783(2016)05-0582-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016072002