鸡骨草保肝降脂有效成分分子对接筛选研究

袁旭江，霍务贞，鲁湘鄂，吴燕红

( 广东药科大学 中药开发研究所/国家中医药管理局三级实验室，广东 广州 510006)



鸡骨草保肝降脂有效成分分子对接筛选研究

袁旭江，霍务贞，鲁湘鄂，吴燕红

( 广东药科大学 中药开发研究所/国家中医药管理局三级实验室，广东 广州 510006)

目的 利用分子对接技术筛选鸡骨草降脂保肝抗感染主要有效物质基础。方法 选取与鸡骨草功效和疾病防治相关的10个活性受体，采用分子对接技术对鸡骨草所含55个已知化合物和7个肝病治疗药物进行模拟筛选，预测化合物的吸收、分配、代谢、排泄和毒性(ADMET)，比较分析各化合物与受体的对接能力。结果 鸡骨草化合物与受体结合的能力大小顺序为酰胺类成分>黄酮类成分>生物碱和其他小分子>皂苷类，从中筛选出23个得分较高的成分，主要为酰胺类成分、黄酮糖苷和小分子等成分，ADMET预测结果提示这些成分不与CYP2D6和血浆蛋白结合，以游离状态进入血液发挥药效作用，可能为鸡骨草保肝降脂抗感染的主要有效成分。结论 本法有助于寻找和筛选鸡骨草保肝降脂最具潜力有效成分，为创新药物研发和提升药材质量评价标准指标选择等方面奠定依据和基础。

分子对接技术； 鸡骨草； 保肝； 降脂； 抗感染； 有效成分

鸡骨草为我国南方特有道地药材，其基源为豆科植物广州相思子(AbruscantoniensisHance)[1]和毛相思子(A.mollisHance)[2]，以全草入药，历来用于急慢性肝炎、黄疸型肝炎、脂肪肝、胃炎等疾病的防治，为多种肝炎防治中成药和凉茶的主要原料[3-4]，民间常用于药膳煲汤。现代研究表明，鸡骨草富含黄酮类、生物碱、酰胺类、皂苷类、有机酸类、蒽醌类、色原酮、木脂素类、氨基酸类等多种化学成分[5-12]，在保肝、抗感染、降血脂、免疫调节等方面活性显著[4,13]，如皂苷类的保肝护肝作用[14]，黄酮类的降脂保肝作用[15-16]，生物碱的保肝护肝作用[17-18]等。除相思子碱和下箴刺酮碱外，鸡骨草的活性作用主要集中在提取物和部位，至今未深入到各个明确的化学成分，各个化学成分活性潜力未见系统研究和分析报道。计算机软件分子对接技术用于药物的活性筛选研究已成为新药或先导药物发现的手段之一[19]。笔者通过计算机模拟软件—分子对接技术，对鸡骨草化学成分与其治疗疾病相关的活性受体进行系统对接分析，探讨其保肝、降脂、抗感染等活性强弱，以期明确鸡骨草最具活性潜力的物质基础，为鸡骨草的质控指标、新药开发和活性研究等提供依据和基础。

1 材料与方法

1.1 计算机软件

Cambridge Soft公司的ChemBioDraw12.0软件对所有化合物进行绘图。Accelrys公司的Discovery Studio2.5软件中的CDDOCK模块(LibDock)进行分子对接计算模拟研究。软件运行环境：Microsoft Windows XP 操作系统。

1.2 配体化合物数据库的建立和准备

采用ChemBioDraw12.0软件绘图工具对鸡骨草的化学成分和阳性化合物进行绘图，并转换成3D模式，采用Chem3D模块进行加氢和加电荷，采用MM2力场对化合物的构象进行能量优化，优化后保存为mol2格式文件，用于分子对接。鸡骨草所含化学成分见表1。

1.3 化合物吸收、分布、代谢、排泄和毒性的预测

采用Discovery Studio2.5软件中的ADMET模块对鸡骨草所含已知化合物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADMET，absorption,distribution,metabolism,excretion and toxicity)的性质进行计算预测[19-20]，了解各个化合物的被动肠内吸收性(intestinal absorption)、25 ℃以下的水溶性(aqueous solubility)、血脑屏障穿透性(blood brain barrier penetration)、人细胞色素P450 2D6 酶结合(CYP2D6 binding)、肝脏毒性(hepatotoxicity)、血浆蛋白结合(plasma protein binding)以及水/辛醇分配系数 (ALogP98)和 2D极性分子表面积(PSA_2D)等各方面的相关数据。

1.4 受体或相关酶的来源和准备

在蛋白数据库(PBD，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)检索并下载与保肝、抗感染、降脂等活性相关的PBD受体，通过Discovery Studio2.5软件打开PBD受体三维模型，删除PBD受体中配体分子和非结合位点的水分子，利用clean protein工具加氢处理，forcefield tool panel中CHARMm工具进行结构调整，补全残基，删除多余蛋白构象，配置好对接口袋，保存为ffmL格式。筛选出相关的受体为：慢性肝炎受体(1PK0.pdb[21]、3ISO.pdb[22]、3IN9.pdb[23])、乙型肝炎受体(3KXS.pdb[24])、脂肪肝炎调控相关的PPARγ受体(2PRG.pdb[25])、降脂相关的脂质运输抑制剂受体(4EWS.pdb[26]、4F2A.pdb[26])、抗感染受体(2Q7R.pdb[27]、4DAJ.pdb[28]、2UVP.pdb[29])。

1.5 配体和受体分子对接

将化合物配体和受体分别输入Discovery Studio2.5软件中，利用CDDOCK模块进行分子对接，完成后输出对接结果，从结果列表中可查看每个化合物配体与受体对接后的各个数值。评价指标：对接能(-kJ/mol)和对接交互能(-kJ/mol)，输出数值越高，说明结合亲和力越大，可预示配体化合物与受体结合的活性越强。

2 结果与分析

2.1 ADMET预测结果

各个化合物ADMET预测结果见表1。可见，相思子碱、下箴刺桐碱、脯氨酸、肌醇甲醚等小分子成分无肝毒性，其余成分均显示有一定的肝毒性。鸡骨草所含各类化学成分肠吸收和血脑屏障透过率情况见图1。可见，鸡骨草大多数化合物能够被肠吸收和透过血脑屏障，主要为分子量较小且非糖苷类的化合物，对于分子量较大且具有空间位阻的成分较难吸收和通过血脑屏障。酰胺类成分不能通过血脑屏障，水溶性和肠吸收一般，不与CYP2D6结合，提示不被破坏或解毒；鸡骨草甲素和乙素不被血浆蛋白结合，说明以游离状态进入体内起效。多数小分子生物碱类成分能通过血脑屏障，具有良好的水溶性和肠吸收，如相思子碱和下箴刺桐碱，多数不与血浆蛋白结合，以游离状态进入体内，唯独相思子碱能与血浆蛋白结合，提示相思子碱可能在体内不以游离状态发挥药效。黄酮苷难以通过血脑屏障，其水溶性和肠吸收一般，不与CYP2D6和血浆蛋白结合，说明以游离状态进入血液；黄酮苷元成分能通过血脑屏障，具有良好的肠吸收，但水溶性一般，能与CYP2D6和血浆蛋白结合，提示可能在体内不以游离状态发挥药效。皂苷类成分基本都能与血浆蛋白结合，提示可能在体内不以游离状态发挥药效，其中皂醇类具有一定血脑屏障通过率，其水溶性一般，但较易被肠吸收，不与CYP2D6结合。糖苷类成分不能通过血脑屏障，肠吸收比皂醇差，但水溶性稍强于皂醇，不能与CYP2D6结合，能与血浆蛋白结合。其他小分子成分具有一定的血脑屏障透过率，溶解性和肠吸收度良好，多数不与CYP2D6结合，有些不被血浆蛋白所结合，提示可以游离状态进入血液发挥药效。

6420-2100150200250300050ADMET_AlogP98ADMET_AlogP98vs,ADMET_PSA_2DADMET_AlogP98Absorption-95Absorption-99BBB-95BBB-99ADMET_PSA_2D

图1 鸡骨草化学成分肠吸收和血脑屏障透过率情况分布图

Figure 1 Distribution of intestinal absorption and blood brain barrier penetration of active compounds in Herba Abri

2.2 与疾病相关受体对接结果

通过CDDOCK模块进行分子对接，计算出配体与受体的对接能(-kJ/mol)和对接交互能(-kJ/mol)，结果显示各类化合物与受体结合的能力大小顺序为酰胺类成分>黄酮类成分>生物碱和其他类>皂苷类，且肝炎药物与受体对接得分较高，提示本研究对接筛选结果具有参照价值，将对接结果得分大于20的化合物归纳为表2。

2.2.1 PPARγ受体2PRG 过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)是肝脏中脂肪酸代谢通路中重要的调节因子，属激素核受体超家族成员，参与脂肪的形成，与肝脏炎性反应的发生与调控有关，是脂代谢相关基因L-FABP的启动子[30]。化合物通过与PPARγ结合并使之活化，从而发挥降脂保肝作用。筛选PPARγ受体的高效配基将为降脂保肝类药物研发提供基础和依据。将化合物与PPARγ受体2PRG进行对接，结果显示，得分最高的为鸡骨草甲素、乙素、阿德福韦酯，其次为GW572016、肝素糖、罗格列酮和N-(4-羟基桂皮酰)酪氨酸，较低的为黄酮类等。其中鸡骨草甲素和乙素与受体的结合的能力稍强于阿德福韦酯。提示该酰胺类化合物可能为新的保肝类PPARγ受体激动剂。

2.2.2 慢性肝炎受体 选择3种慢性肝炎相关的受体3ISO、1PK0和3IN9进行对接研究，以更好筛选鸡骨草中最具潜力的肝炎防治成分。结果提示有效成分与受体结合能力强弱分别为：酰胺类>黄酮>有机酸和相思子碱；其中鸡骨草甲素和乙素与受体结合能力并不亚于阳性药物阿德福韦酯，得分达到50以上；其他成分稍弱于肝素糖和磷酸胆碱。提示鸡骨草防治肝炎的主要成分可能为酰胺类和黄酮类。

表1 鸡骨草化学成分ADMET预测结果数据表Table 1 Results of the ADMET forecast of active compounds in Herba Abri

(续表)

表2 鸡骨草化学成分与受体结合能力预测结果表(得分>20)Table 2 Results of the binding capacity forecast of active compounds in Herba Abri and receptors

注：A为对接能(-kJ/mol)，B为对接交互能(-kJ/mol)，“-”表示该处得分低于20。

2.2.3 乙型肝炎受体 从乙型肝炎受体3KXS对接结果可见，鸡骨草中只有8个化合物得分在20以上，与受体结合能力仍以酰胺类最强，与阿德福韦酯相当，得分50左右；芹菜素、原儿茶酸和相思子碱也具有一定的作用，但稍弱于肝素糖和磷酸胆碱等阳性药物。结果提示鸡骨草含有少数与乙型肝炎防治有关的成分。

2.2.4 脂质运输抑制剂受体L-FABP属于脂肪酸结合蛋白家族的成员之一，主要在肝脏、小肠、肾脏及胰腺等组织细胞中有表达，是肝脏内唯一表达的脂肪酸结合蛋白，其水平的改变与脂肪肝发生发展有密切关系[31]。脂肪酸结合蛋白与脂类代谢关系的研究已成为国内外众多学者关注的焦点。通过对化合物与L-FABP受体的对接结合分析，为开发作用L-FABP靶点药物及鸡骨草防治肝炎物质基础奠定基础。

选择2种脂质运输抑制剂受体4EWS和4F2A进行对接研究，对接结果显示，鸡骨草酰胺类化合物与受体结合能力依然最强，得分在60以上，略高于阿德福韦酯，其次为黄酮苷元和蒽醌类成分，相思子碱对接得分低于20。提示鸡骨草具有降脂保肝最强活性成分可能为酰胺类。

2.2.5 抗感染受体 选择2种脂氧合酶相关受体2Q7R和4DAJ和1种胃炎相关受体2UVP进行对接研究，对接结果显示，得分较高分别为鸡骨草酰胺类>黄酮苷元>蒽醌类成分。提示鸡骨草抗炎活性成分可能为酰胺类化合物和芹菜素、木犀草素等黄酮苷元，相思子碱较弱。

2.3 氨基酸残基分析

以PPARγ受体2PRG为例(见图2A)，通过软件中Receptor-Ligand Interactions功能对得分最高前3个化合物进行配体对接姿态分析，均方根偏差(RMSD，root-mean-square deviation)值计算，分析对接的氨基酸残基，结果显示：鸡骨草甲素(abrusamide A)具有10个对接位点，最佳对接位点上有4个氨基酸残基与它形成氢键连接，分别为285位半胱氨酸、343位谷氨酸、342位丝氨酸、271位谷氨酸，鸡骨草甲素与2PRG对接情况见图2B。鸡骨草乙素(abrusamide B)具有10个对接位点，最佳对接位点上有5个氨基酸残基与它形成氢键连接，分别为272位GLU谷氨酸、271位谷氨酰胺、343位谷氨酸、342位丝氨酸、340谷氨酸，鸡骨草乙素与2PRG对接情况见图2C。阿德福韦酯具有10个对接位点，最佳对接位点上有2个氨基酸残基与它形成氢键连接，分别为364位甲硫氨酸、342位丝氨酸，阿德福韦酯与2PRG对接情况见图2D。

A. 2PRG受体图及其结合位点； B.鸡骨草甲素与2PRG对接图； C.鸡骨草乙素与2PRG对接图； D.阿德福韦酯与2PRG对接图。

图2 优势受体与PPARγ受体2PRG对接图

Figure 2 Docking diagram of optimum active compounds and PPARγ 2PRG

3 讨论

通过ADMET预测结果和肝炎疾病相关受体对接结果的综合分析，提示鸡骨草的主要活性成分为酰胺类成分、黄酮糖苷和小分子成分，不与CYP2D6和血浆蛋白结合，提示能够以游离状态进入血液发挥药效作用。

通过与相关疾病受体对接，结果显示鸡骨草各类化合物与受体结合的能力大小顺序为酰胺类成分>黄酮类成分>生物碱和其他类>皂苷类。各类阳性肝炎药物与慢性肝炎受体对接得分均较高，提示结果具有参照价值，其中阿德福韦酯为核苷酸类肝炎药物，对接得分最高，肝素糖第二，但阿德福韦酯的对接得分稍低于鸡骨草甲素和乙素。

通过综合分析各类疾病受体对接结果，提示鸡骨草在防治慢性肝炎及其相关疾病方面最具活性潜力的有效成分为：鸡骨草甲素、鸡骨草乙素、N-(4-羟基桂皮酰)酪氨酸、相思子碱、芹菜素和木犀草素及其糖苷、查尔酮类、原儿茶酸、异落叶松树脂醇、大黄素和大黄素甲醚，其中以酰胺类成分得分最高，酰胺类和黄酮类成分在降脂方面活性潜力优于大黄素和大黄素甲醚，提示上述化合物为鸡骨草保肝、降脂、抗感染的主要活性成分。从对接受体结果可以看出，鸡骨草甲素和乙素与PPARγ和L-FABP受体结合明显优于其他成分，提示该类化合物可能具有调节PPARγ和L-FABP表达的功能，通过改善肝脂肪变性和炎性反应，有效地抑制脂肪肝的发生和发展。本研究将促进双调节PPARγ和L-FABP表达的降脂保肝药物的研发。从质量评价角度考虑，对接结果提示鸡骨草甲素、鸡骨草乙素、N-(4-羟基桂皮酰)酪氨酸、相思子碱以及黄酮类成分可以作为鸡骨草药材质量评价指标，其中相思子碱已选入2015年版《中国药典》[1]。同时，中药材所含化学成分丰富多样，每个成分在某一疾病可能体现较强活性潜力，但其药理作用仍呈现多样性，本文研究结果提示中药材在防治疾病过程中可能为多成分多靶点共同作用的结果，为药物研发以及药材质量标准奠定基础。

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(责任编辑：陈翔)

Screening of the hepatoprotective and lipid-lowering active compounds from Herba Abri by molecular docking technology

YUAN Xujiang,HUO Wuzhen,LU Xiang′e,WU Yanhong

(Research&DevelopmentInstituteofChineseMateriaMedica,GuangdongPharmaceuticalUniversity/ClassⅢLaboratoryofModernChineseMedicinePreparation,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Objective To screen and predict the potential hepatoprotective,lipid-lowering and anti-inflammatory active compounds from Herba Abri by molecular docking technology. Method 10 active receptors related with liver diseases were docked with 55 compounds of Herba Abri and 7 positive hepatic drugs for prediction of their absorption,distribution,metabolism,excretion and toxicity (ADMET) and comparative analysis of docking energy． Result The docking energy of all the compounds were in the order:amides > flavonoids > alkaloids and other small molecules > saponins. The 23 compounds′ scores above 20 were consisted of amides,flavonoid glycosides and small molecules. ADMET suggested that they did not combine with CYP2D6 or plasma protein and could enter the blood and play a role in the free state. The results indicated these molecules were possibly the main active compounds in Herba Abri with hepatoprotective,lipid-lowering and anti-inflammatory effects. Conclusion The method is helpful to find out the most potential active compounds from Herba Abri with hepatoprotective,lipid-lowering and anti-inflammatory effects,and to lay a good foundation for innovative drug development and improving the index selection of medicinal quality evaluation standard.

Molecular docking; Herba Abri; hepatoprotective; lipid-lowering; anti-inflammatory; active compounds

2016-06-23

广东省自然科学基金博士启动项目(2016A030310302); 广东省科学技术厅-广东中医药科学院科研联合项目(2014A020221105)

袁旭江(1976—)，男，博士，副研究员，主要从事中药质量标准、资源开发与新药研究，电话:020-39352540,Email:xjyuan.xj@163.com。

时间：2016-10-19 16:44:26

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161019.1644.002.html

R282.1

A

1006-8783(2016)05-0565-07

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062302