褐飞虱看家基因启动子克隆与序列分析

彭 雷，赵 艳，马银花

（1.贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550001；2.武汉大学生命科学学院，湖北武汉430072）

褐飞虱看家基因启动子克隆与序列分析

彭 雷1，赵 艳2，马银花2

（1.贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550001；2.武汉大学生命科学学院，湖北武汉430072）

为获得组成型表达启动子，以褐飞虱的看家基因肌动蛋白（Acting1）与甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）为研究对象，以Genbank上褐飞虱Actin1mRNA序列设计嵌套引物，通过灰飞虱GAPDHmRNA序列搜寻褐飞虱EST数据库中的同源序列设计嵌套引物，并以设计的嵌套引物通过Tail-PCR技术对褐飞虱Actin 1与GAPDH基因ATG前侧翼序列进行扩增。结果表明：通过染色体步移的Tail-PCR技术获得Actin1与GAPDH基因ATG前侧翼序列，长度分别为2 878bp和1 196bp。BDGP数据库与PLACE软件在线分析获得核心启动子序列及TATA框、CAAT框和GATA框元件。

褐飞虱；Actin1；GAPDH；启动子；Tail-PCR

在基因工程研究中，高效启动子能启动外源基因高水平表达，但要在某物种中达到组成型表达目的基因常需要此物种的看家基因启动子。肌动蛋白β-actin和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）启动子是常用的看家基因启动子。启动子克隆一般通过染色体步移技术，染色体步移技术主要基于2种方法，一种是基于基因组文库为主要手段的染色体步移技术，一种是基于PCR技术的染色体步移技术。基于PCR技术的染色体步移主要又分为连接成环PCR、外源接头介导PCR和半随机引物PCR［1］。热不对称交错PCR（Tail-PCR）是基于半随机引物的PCR方法。Tail-PCR方法最先由Liu和Whittier提出［2］，该技术具有简单快速、高效特异并能对产物直接测序等优点，目前已广泛运用于启动子克隆、鉴定转基因中T-DNA插入位点、获得新物种基因非保守区域等研究领域。褐飞虱（NilaparvatalugensStål，BPH）是对水稻危害最大的害虫之一，在亚洲褐飞虱每年造成水稻减产［3］，对褐飞虱研究越来越受到昆虫学、植保学和生态学家的重视。但目前对褐飞虱的研究中，高效组成型表达启动子分离的相关研究尚无报道。笔者利用NCBI上褐飞虱Actin1和灰飞虱（Laodelphaxstriatella）GAPDH基因mRNA全长序列设计嵌套引物，并通过Tail-PCR技术获得褐飞虱看家基因肌动蛋白与甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的ATG前端启动子区序列，以期分离到褐飞虱具有高效性启动基因表达能力的组成型表达启动子，为外源基因在褐飞虱细胞内高效表达乃至褐飞虱转基因相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试褐飞虱饲养在温室，饲养条件为22～28℃，保持合适的光照湿度条件（光照15h/d），以保证水稻和褐飞虱在良好环境下生长。Top 10感受态细胞为实验室保存，PMD18-T载体与Genome walking（染色体步移技术）试剂盒购自大连保生物公司（Takara），PCR产物胶回收试剂盒购自Omega。其他试剂为国产或进口分析纯。

表1 不同引物的信息Table 1 Information of different primers

1.2 褐飞虱基因组DNA提取

褐飞虱基因组DNA提取皆为单头虫提取。参照文献［4-5］的CTAB法，略有改动。将采集的单头褐飞虱放入装有400μL%的CTAB（1.5mL的离心管中，用匀浆小棒捣碎匀浆）；将匀浆液放入60℃水浴锅水浴60min裂解；裂解完毕后的匀浆液中加入200μL氯仿/异戊醇（24∶1）抽提2次；加入2倍体积无水乙醇-20℃沉淀；最后DNA风干后溶于50μL TE溶解-20℃保存备用。

1.3 扩增引物

从genbank上登录的褐飞虱Actin1mRNA序列设计了3条特异引物，第2次Tail-PCR的3条特异引物以第1次Tail-PCR测序后的序列为基础设计；通过灰飞虱的mRNA序列并结合褐飞虱EST数据库序列设计3条特异引物（表1）；简并引物为试剂盒的AP2、AP3和AP4引物。

1.4 Tail-PCR扩增

3轮反应总体系50μL，包括1μL模板；2.5mmol/L dNTPs 8μL；10×LA PCR Buffer II（Mg2＋plus）5μL；LA Taq（5U/μL）0.5μL；AP与特异引物（100pmol/μL）各1μL；加ddH2O至50μL。以Actin1第1次Tail-PCR为例，试剂盒的AP2、AP3、AP4引物分别首先与A1W1-1引物进行第1轮扩增，扩增产物为模板，再加入各自对应AP简并引物和A1W1-2引物进行第2轮扩增，同理以A1W1-3引物和AP引物进行第3轮扩增，第3轮扩增完毕后电泳选取扩增带型效果好的组合。PCR反应条件参照Genome Walking试剂盒说明书。

1.5 PCR产物测序与序列分析

将扩增产物用DNA胶回收试剂盒回收后，直接连接PMD18-T载体，转化Top10感受态细胞，挑选阳性克隆测序。序列先在genbank blatsn进行比对，确定是否为目的序列。通过BDGP（Berkeley drosophilae genome project）数据库（http：//www.fruitfly.org/seq＿tools/promoter.html）中Neural Network Promoter Prediction软件预测启动子序列。PLACE在线启动子预测工具分析启动子功能元件。

2 结果与分析

2.1 Tail-PCR的扩增片段

对于Actin 1基因，3条特异引物分别于试剂盒（AP2、AP3、AP4简并引物组合）扩增，AP2组合能扩增到1条约1.1kb的片段（图1a），连接PMD18-T测序后和genbank的Actin1基因及褐飞虱EST数据库blast比对后证实为褐飞虱Actin1基因ATG前端序列。根据测序结果，又设计3条特异性引物继续向前walking，Tail-PCR后获得约2kb片段（图1b），测序后将其与前面测序结果拼接获得ATG前端总共2 878bp长度的序列。对于GAPDH，3条特异引物和AP3组合，扩增到约1.2kb片段（图1c），测序后比对确定为GAPDHATG前端序列。

图1 TAIL-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of Tail-PCR products

2.2 启动子序列

将得到的Actin1ATG上游序列通过BDGP数据库与PLACE软件在线分析，BDGP数据库分析获得2条核心启动子序列（图2），2个核心序列离ATG距离分别为4 3 6bp和3 6 3bp。PLACE软件在线分析预测TATA框、GAAT框和CAAT框等启动子核心原件（图2），其中TATA框距离ATG为504bp和993bp；GAAT框距离ATG为218bp和760bp；CAAT框距离ATG为563bp和 1 002bp。GAPDH ATG上游序列在genbank的EST数据库blast，并未匹配到相应的5′UTR序列（图3），因此推测在ATG到5′UTR区存在较长的内含子。

图2 褐飞虱Actin1基因启动子区序列Fig.2 Sequence of brown planthopperActin1promoter region

图3 褐飞虱GAPDH基因ATG上游序列Fig.3 ATG upstream sequence of brown planthopperGAPDHgene

3 讨论

肌动蛋白与甘油醛-3-磷酸脱氢酶都是普遍存在高度保守的蛋白，参与细胞中许多重要代谢过程，作为看家基因在各个组织与各个时期均能表达。其启动子常作为组成型表达启动子启动目的基因高效表达。如家蚕（Bombyxmori）与两点蟋（two-spotted cricket，Gryllusbimaculatus）转基因用Actin基因的启动子［6-7］。克隆启动子的方法多采用基于PCR的染色体步移技术，而Tail-PCR又是比较常用的技术，其基于巢式PCR原理，3次热不对称PCR即可获得侧翼序列，该技术具有简单快速、高效特异并能对产物直接测序等优点［8］。本研究通过Tail-PCR技术获得褐飞虱Actin1基因ATG上游2 878bp序列，GAPDH基因ATG上游1 196bp序列。但GAPDHATG前端为内含子，未得到启动子区序列。Actin1则成功获得启动子区序列，通过BDGP数据库Neural Network Promoter Prediction软件预测启动子2个核心序列离ATG距离分别为436bp和363bp，同时运用PLACE软件在线分析启动子区的各元件。本研究成功克隆了Actin1基因启动子区序列，为外源基因在褐飞虱细胞内高效表达，乃至褐飞虱转基因相关研究奠定基础。

［1］刘 博，苏 乔，汤敏谦，等.应用于染色体步移的PCR扩增技术的研究进展［J］.遗传，2006，28（5）：587-595.

［2］LIU Y G，MITSUKAWA N，OOSUMI T，et al.Effi-cient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana TDNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR［J］.The Plant Journal，1995，8（3）：457-463.

［3］FUJITA D，MYINT K K M，MATSUMURA M，et al.The genetics of host-plant resistance to rice planthopper and leafhopper［M］.Planthoppers：New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia.Los Banos（Philippines）：Int.Rice Res.Inst，2009：389-400.

［4］MAGUIRE T L，COLLINS G G，SEDGLEY M.A modified CTAB DNA extraction procedure for plants belonging to the family Proteaceae［J］.Plant Molecular Biology Reporter，1994，12（2）：106-109.

［5］TANG M，LV L，JING S，et al.Bacterial symbionts of the brown planthopper，Nilaparvata lugens（Homoptera：Delphacidae）［J］.Applied and environmental microbiology，2010，76（6）：1740-1745.

［6］TAMURA T，THIBERT C，ROYER C，et al.Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L.using apiggyBac transposon-derived vector［J］.Nature biotechnology，2000，18（1）：81-84.

［7］SHINMYO Y，MITO T，MATSUSHITA T，et al.Piggy Bac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket，Gryllus bimaculatus［J］.Development，growth ＆differentiation，2004，46（4）：343-349.

［8］陈军营，孙 佩，王德勤，等.一种改良的克隆小麦GLP3基因启动子的TAIL-PCR技术［J］.植物生理学通讯，2007，43（4）：754-758.

（责任编辑：刘忠丽）

Cloning and Sequence Analysis of Brown Planthopper House-keeping Gene Promoter

PENG Lei1，ZHAO Yan2，MA Yinhua2
（1.CollegeofLifeSciences，GuizhouNormalUniversity，Guiyang，Guizhou550001；2.CollegeofLife Sciences，WuhanUniversity，Wuhan，Hubei430072，China.）

The ATG front flanking sequence ofNilaparvatalugensActing 1andLaodelphaxstriatellaGAPDH was amplified by Tail-PCR from designed nested primers based on nested primers designed from Nilaparvata lugens Actin 1mRNA sequence in Genbank and the nested primers designed from the homologous sequence inNilaparvatalugensEST database by searchingLaodelphaxstriatellaGAPDHmRNA sequence.Results：The length of ATG front flanking sequence ofActing1andGAPDHis 2 878bp and 1 196bp respectively.The core promoter sequence，TATA box，CAAT box and GATA box are obtained by on-line analysis of BDGP database and PLACE software.

brown planthopper；Actin1；GAPDH；promoter；Tail-PCR

S435.112＋.9

A

2015-05-15；2016-09-01修回

国家自然科学基金项目“水稻抗褐飞虱基因多样性持续控制褐飞虱的分子机理”（31230060）

彭 雷（1980-），男，实验师，博士，从事水稻与褐飞虱互作研究。E-mail：daylight898＠sina.com

1001-3601（2016）09-0369-0004-04