海洋细菌Halomonas elongate的次级代谢产物研究

苗子，马小妮，程轩轩，夏金梅，杨全

(1 .广东药学院 中药学院，广东 广州 510006； 2.国家海洋局第三海洋研究所 海洋生物资源遗传重点实验室，福建 厦门 361005)



海洋细菌Halomonaselongate的次级代谢产物研究

苗子1，2，马小妮1，2，程轩轩1，夏金梅2，杨全1

(1 .广东药学院 中药学院，广东 广州 510006； 2.国家海洋局第三海洋研究所 海洋生物资源遗传重点实验室，福建 厦门 361005)

摘要:目的 对具有抗肿瘤活性的海洋细菌Halomonas elongate进行次级代谢产物的分离、纯化及抗肿瘤活性研究。方法 通过大孔吸附树脂、硅胶、ODS、Sephadex LH-20凝胶柱色谱等分离纯化手段，对H. elongate的次级代谢产物进行分离纯化；根据1H NMR谱、13C NMR谱及MS分析，并结合文献确定结构；采用MTT法对分离得到的次级代谢产物进行活性检测。结果 从海洋细菌H. elongate的发酵粗提物中分离鉴定3个化合物，分别为胸腺嘧啶-2′-脱氧核苷(1)、环(L-甘氨酸-L-脯氨酸)二肽(2)、1-(2′-脱氧-β-D-赤式-呋喃戊糖)-1氢-1,2,4-三嗪酮(3)，活性检测结果显示3个化合物对人肺癌细胞H1299生长活性均无显著抑制作用(IC50>20 μmol/L)。结论 化合物1～3均为首次从Halomonas中分离得到。

关键词:Halomonas elongate； 海洋细菌； 次级代谢产物； 结构鉴定

近几十年来，陆地微生物来源的新先导化合物数量逐渐减少[1]。海洋微生物因所处的高盐等极端环境，形成了独特的代谢途径，代谢产物也因此具有更多样的结构和更广泛的活性。据统计，截至2010年，人们已分离得到超过20 000个海洋微生物来源的化合物，其中，以含氮化合物、酰胺、环肽和吲哚生物碱为主[2-3]。这些化合物大多具有广泛的活性，如抗菌、抗肿瘤、抗病毒等[2]。因此在陆地微生物资源日益匮乏的今天，海洋微生物成了重要的药物开发资源[3]。目前，人们对海洋微生物的研究更多集中于海洋放线菌和海洋真菌，对海洋细菌的研究较少[4]。

在本实验室的前期研究中，海洋细菌Halomonaselongate的发酵液粗提物经活性测试表现出较好的体外抗人肺癌细胞(H1299)生长活性(在20 μmol/L时，抑制率为80%)。本文对该菌株的次级代谢产物及生物活性进行研究，共分离得到3个化合物，经鉴定为胸腺嘧啶-2′-脱氧核苷(1)、环(L-甘氨酸-L-脯氨酸)二肽(2)、1-(2′-脱氧-β-D-赤式-呋喃戊糖)-1氢-1,2,4-三嗪酮(3)，均为首次从Halomonas分离得到。3个化合物的结构式见图1。

图1化合物1～3的结构

Figure 1Structures of compounds 1-3

1仪器与材料

1.1菌株

海洋细菌菌株Halomonaselongate购于ATCC(ATCC 33173)，为革兰阴性菌，在2216E培养基上菌落呈白色，半透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，菌落形态大小2～3 mm，生长盐度为3.4%，最适生长温度为20～26 ℃，好氧菌。

1.2细胞

H1299(人肺癌细胞)购自中国科学院上海生化细胞所。

1.3培养基

2216E培养基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，陈海水，pH 7.4～7.6(培养基121 ℃ 高压灭菌30 min，待冷却至30 ℃左右使用)。

1.4仪器与材料

Bruker AV500和Bruker AV400核磁共振波谱仪(美国Bruker公司)；Xevo G2 Q-Tof四极杆飞行时间质谱仪(美国Waters公司)；EYELA旋转蒸发仪(日本东京理化株式会社)；IS-RDS3C恒温振荡器(美国精骐有限公司)；分析型薄层色谱硅胶板和柱色谱硅胶(烟台江友硅胶有限公司)；Sephadex LH-20凝胶(40～70 μm，Amersham Pharmacia)；其余试剂均为市售分析纯。

2菌株发酵和次级代谢产物分离

2.1菌株发酵

从固体平板培养基上选取大小适中的单菌落，挑取适量接入200 mL液体培养基(置于1 L三角烧瓶)中，28 ℃、180 r/min培养24 h；将一级种子按5%(体积比，下同)接种量，接入1 L液体培养基(置于5 L三角烧瓶)中，28 ℃、180 r/min培养24 h；将二级种子按5%接种量，接入40 L液体培养基(置于50 L发酵罐)，28 ℃、180 r/min、通气量28 L/min培养72 h，得到约35 L发酵液。

2.2发酵液处理

发酵液离心后，上清液经大孔吸附树脂梯度洗脱(乙醇-水，10∶90→95∶5)，洗脱液减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体经水混悬，混悬液经1 200～1 300 kPa均质后，16 000 r/min离心，上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩，合并菌液和菌体提取物，得到发酵粗提物4 g。

2.3次级代谢产物分离

将粗提物经ODS中压柱(甲醇-水，5∶95→100∶0)，得到17个流分(Fr.1～ Fr.17)。Fr. 13(470.3 mg)经凝胶Sephadex LH-20柱色谱洗脱(甲醇)，再经正相硅胶柱(100～200目，三氯甲烷-甲醇，体积比5∶1)纯化，得到化合物1(16.8 mg)。Fr. 14(344.7 mg)经凝胶Sephadex LH-20柱色谱洗脱(甲醇)，再经正相硅胶柱色谱(100～200目，三氯甲烷-甲醇，体积比5∶1)纯化，得到化合物2(92.1 mg)。Fr. 16(299.2 mg)经凝胶Sephadex LH-20柱洗脱(甲醇)，再经HPLC(乙腈-水，体积比5∶95)制备，得到化合物3(5.5 mg)。

3化合物鉴定

化合物1：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z184[M-H]-。1H NMR (MeOD，500 MHz)δ：7.82 (1H，d，J=1.5 Hz，H-6)，6.28 (1H，t，J=2.0 Hz，H-1′)，4.61 (1H，s，H-3′)，4.40 (1H，dt，J=6.0，3.5 Hz，H-4′)，3.91 (1H，dt，J=3.5，3.5 Hz，H-5′)，3.80 (1H，m，H-5)，3.75 (3H，s，H-3′)，2.24 (1H，m，H-2′)，1.88(3H，d，J=1.0 Hz，H-7)。13C NMR (MeOD，125 MHz)δ：166.6 (C，C-4)，152.5 (C，C-2)，138.3 (C，C-6)，111.7 (C，C-5)，88.9 (C，C-1′)， 6.4 (C，C-4′)，72.4 (C，C-3′)，63.0 (C，C-5′)，41.3 (C，C-2′)，12.6 (C，C-7)。以上波谱数据与文献[5]报道一致，故确定化合物1为胸腺嘧啶-2′-脱氧核苷(thymidine)。

化合物2：淡黄色无定形固体(甲醇)，ESI-MSm/z155 [M+H]+。1H NMR (DMSO，500 MHz)δ：4.12 (1H，t，J=8.5 Hz，H-6)，3.99 (1H，d，J=20.5 Hz，H-3a)，3.50 (1H，dd，J=20.5，5.5 Hz，H-3b)，3.35(1H，dd，J=9.5，4.0 Hz， H-5a，H-5b)，2.12 (1H，m，H-7a)，1.85 (1H，m，H-7b)，1.82 (1H，m，H-6a)，1.77 (1H，m，H-6b)。13C NMR (DMSO，125 MHz)δ：169.4 (C，C-1)，163.9 (C，C-4)，58.0 (C，C-9)，45.9 (C，C-5)，44.7 (C，C-3)，27.9 (C，C-7)，22.1 (C，C-6)。以上波谱数据与文献[6]报道一致，故确定化合物2为环(L-甘氨酸-L-脯氨酸)二肽[cyclo(L-Gly-L-Pro)]。

化合物3：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z184 [M+H]+。1H NMR (MeOD，500 MHz)δ： 8.32 (1H，s，H-4)，8.17 (1H，s，H-2)，6.42 (1H，dd，J=11.0，8.0 Hz，H-1′)，4.58 (1H，m，H-4′)，4.08 (1H，m，H-3′)，3.85 (1H，dd，J=12.5，3.0 Hz，H-5′a)，3.75 (1H，dd，J=12.5，3.5 Hz，H-5′b)，2.81 (1H，m，H-2′a)，2.42 (1H，m，H-2′b)。13C NMR (MeOD，125 MHz)δ：153.6 (C，C-2)，141.7 (C，C-4)，90.0 (C，C-1′)，87.3 (C，C-4′)，73.2 (C，C-3′)，63.8(C，C-5′)，41.6 (C，C-2′)。以上波谱数据与文献[7-8]报道一致，故确定化合物3为1-(2′-脱氧-β-D-赤式-呋喃戊糖)-1氢-1,2,4-三嗪酮[1-(2′-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1H-1,2,4-triazone]。

4体外细胞生长抑制活性测试

人肺癌细胞H1299常规消化后，重悬吹打成细胞悬液，以每孔200 μL、2×103～5×103个细胞加入96孔板，以不含细胞的等量培养液的孔为空白对照；于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h，分别加入5、10、15、20 μmol/L浓度化合物处理细胞，继续培养72 h；每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37 ℃避光反应3 h；小心吸弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min使结晶物充分溶解；用酶标仪测定570 nm波长处的吸光度，计算抑制率。

结果显示，化合物1～3对体外人肺癌细胞H1299生长抑制活性的IC50>20 μmol/L，表明3个化合物对人肺癌细胞H1299均无抑制活性。

5讨论

本研究从海洋细菌Halomonaselongate中分离得到3个化合物，其中化合物2为环二肽类化合物。据报道，海洋微生物环二肽化合物具有多种活性，如抗菌、抗肿瘤等[9]。本研究中分离得到的1个环二肽类化合物、1个三唑化合物及1个核苷在体外人肺癌细胞(H1299)生长抑制活性测试中均无活性，提示这3个化合物可能不是H.elongate次级代谢产物中的抗肿瘤活性成分，H.elongate次级代谢产物中其他活性成分及其生物活性有待扩大发酵后进一步研究。

参考文献:

[1] BULL A T,WARD A C,GOODFELLOW M. Search and discovery strategies for biotechnology:the paradigm shift[J]. Microbiol Mol Biol,2000，64(3):573-606.

[2] KELECOM A. Secondary metabolites from marine microorganisms[J].An Acad Bras Ciênc,2002，74(1):151-170.

[3] BÉRDY J. Thoughts and facts about antibiotics: where we are now and where we are heading[J].J Antibiot,2012，65(8):385-395.

[4] BLUNT J W,COPP B R,KEYZERS R A,et al. Marine natural products[J].Nat Prod Rep,2015，32(2):116-211.

[5] 靳荣线，曹艳茹，苗翠苹，等.链霉菌YIM 245次生代谢产物的研究[J].天然产物研究与开发，2012，24(1)：1-4.

[6] JIANG Z,BOYD K G,MEARNS-SPRAGG A,et al. Two diketopiperazines and one Halogenated phenol from cultures of the marine bacterium,Pseudoalteromonasluteoviolacea[J].Nat Prod Lett,2000，14(6):435-440.

[7] HUANG R,ZHOU X,PENG Y,et al. Nucleosides from the marine spongeCallyspongiasp.[J].Chem Nat Compd,2011，46(6):1010-1011.

[8] MÜLLER J,BÖHME D,LAX P,et al. Metal ion coordination to azole nucleosides[J].Chemistry,2005，11(21):6246-6253.

[9] 杨子娟，向兰，邢杰，等.环二肽的研究进展[J].现代药物与临床，2009，24(2)：73-81.

(责任编辑：陈翔)

Study on the secondary metabolites from the marine bacteriumHalomonaselongate

MIAO Zi1,2,MA Xiaoni1,2,CHENG Xuanxuan1,XIA Jinmei2,YANG Quan1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.KeyLaboratoryofMarineBiogeneticResources,ThirdInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Xiamen361005,China)

Abstract:Objective To isolate and purify antitumor-active secondary metabolites from Halomonas elongate and study their antitumor activity. Methods Compounds were isolated and purified by column chromatography over macroporous resin,silica gel,ODS and Sephadex LH-20. The structures of secondary metabolites were identified by1H NMR,13C NMR,MS and reference data. The cytotoxic assay was performed by using MTT method. Results Three compounds were isolated from the crude abstract of zymotic fluid of H. elongate and identified as thymidine (1),cyclo(L-Gly-L-Pro) (2),and 1-(2′-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1H-1,2,4-triazone (3). All three compounds didn′t show antitumor activity against human lung cancer cell H1299(IC50>20 μmol/L). Conclusion All three compounds were isolated for the first time from the marine bacterium Halomonas elongate．

Key words:Halomonas elongate； marine bacteria； secondary metabolites; structural identification

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015111301

中图分类号：R284.2

文献标志码：A

文章编号:1006-8783(2016)01-0029-03

作者简介：苗子(1989—)，女，2013级硕士研究生，Email：miaoziiris@163.com；通信作者：杨全(1972—)，男，博士，教授，主要从事中药资源方面研究，Email：yangquan7208@vip.163.com。

基金项目：国家海洋局第三海洋研究所基本科研业务费专项资金资助项目(2015028)；海洋经济创新发展区域示范专项经费资助项目(GD2012-D01-001)

收稿日期：2015-11-13

网络出版时间：2016-01-15 16:44网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1644.003.html