深海细菌Psychrobacter submarinus 1A01998的次级代谢产物研究

马小妮，苗子，程轩轩，杨全

(1 .广东药学院 中药学院，广东 广州 510006； 2.国家海洋局第三海洋研究所 海洋生物资源遗传重点实验室，福建 厦门 361005)



深海细菌Psychrobactersubmarinus1A01998的次级代谢产物研究

马小妮1，2，苗子1，2，程轩轩1，杨全1

(1 .广东药学院 中药学院，广东 广州 510006； 2.国家海洋局第三海洋研究所 海洋生物资源遗传重点实验室，福建 厦门 361005)

摘要:目的 对来自深海沉积物中的海洋细菌Psychrobacter submarinus 1A01998的次级代谢产物进行研究。方法 采用大孔吸附树脂、硅胶、ODS和Sephadex LH-20凝胶等柱层析色谱分离方法，对海洋细菌Psychrobacter submarinus 1A01998进行次级代谢产物的分离纯化，根据1H NMR、13C NMR和MS 等波谱数据分析并结合相关文献对化学结构进行鉴定。结果 从深海细菌Psychrobacter submarinus 1A01998的发酵粗提物中分离得到4个化合物，分别鉴定为环(L-脯氨酸-L-酪氨酸)(1)、环(D-脯氨酸-L-酪氨酸)(2)、3-吲哚甲醛(3)、2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷(4)。结论 化合物1～4均为首次从该属中分离得到，其中化合物1、2为环二肽类化合物。

关键词:海洋细菌； Psychrobacter submarinus 1A01998； 次级代谢产物

自1960年以来，从海洋生物及微生物中已发现了20 000多种化合物[1]，它们大多具有新颖的结构和较好的生物活性，例如一些从海洋微生物中得到的次级代谢产物对目前的超级细菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，耐万古霉素肠球菌)具有很强的抑制活性[2]，新近发现的apratoxin H、decaturin E和decaturin F等均具有很强的抗肿瘤活性[3]。据统计，截止至2010年，约有45个来自海洋的天然产物已经或者正在进行Ⅰ～Ⅲ期临床研究，其中80%以上均为抗肿瘤药物[4]。据文献[3]报道，2013年全世界从海洋(包括红树林)中发现的新化合物来自海洋放线菌的有116个，来自海洋真菌的有302个，而来自海洋细菌的仅有53个。由此可见，目前对海洋微生物研究的对象主要还是海洋真菌和海洋放线菌，对细菌的研究相对较少。因此，对海洋细菌，尤其是深海细菌进行深入研究具有广阔的前景。本课题组前期从西太平洋海底沉积物中分离得到1株嗜冷杆菌(Psychrobactersubmarinus1A01998)，其粗提物表现出较好的抗肿瘤活性，本文对其次级代谢产物进行系统的研究，拟从中发现抗肿瘤活性成分。

1仪器与材料

1.1菌株

深海细菌菌株Psychrobactersubmarinus1A01998于2006年12月分离自西太 平洋海底沉积物(-1 914 m;E 142°30′,S 8°00′)，菌落呈黄色，表面湿润，与模式菌株PsychrobactersubmarinusKMM 225(T) AJ309940相似性为99.5%，鉴定为Psychrobactersubmarinus1A01998，该菌株保藏于国家海洋微生物菌株保藏中心(保藏号：MCCC1A01998)。

1.2细胞

H1299(人肺癌细胞)购自中国科学院上海生化细胞所。

1.3培养基

2216E培养基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，陈海水，pH 7.4～7.6(培养基121 ℃高压灭菌30 min，待冷却至30 ℃左右使用)。

1.4仪器与材料

Bruker AV500核磁共振波谱仪(美国Bruker公司)；Bruker AV400核磁共振波谱仪(美国Bruker公司)；Xevo G2 Q-Tof四极杆飞行时间质谱仪(美国Waters公司)；Eyela旋转蒸发仪(日本东京理化公司)；IS-RDS3C恒温振荡器(美国精骐有限公司)；分析型、制备型薄层色谱硅胶板和柱色谱硅胶(烟台江友硅胶有限公司)；Sephadex LH-20凝胶(40～70 μm，Amersham Pharmacia公司)；其余试剂均为市售分析纯。

2菌株发酵和次级代谢产物分离

2.1发酵

将适量的培养皿上的深海细菌Psychrobactersubmarinus1A01998接入到300 mL的液体培养基中(置于1 L锥形培养瓶)，28 ℃、180 r/min培养2 d，将一级种子培养液以5%(体积分数，下同)的接种量接种到1 L的液体培养基(置于5 L锥形培养瓶)中，28 ℃、180 r/min培养2 d，将二级种子培养液以5%的接种量接种到40 L液体发酵培养基(置于50 L发酵罐)中，接种量为1%(体积分数)，设置28 ℃、180 r/min连续培养发酵5 d，最终得到发酵液35 L。

2.2次级代谢产物分离

发酵液离心后，滤液用大孔吸附树脂梯度洗脱(乙醇-水，体积比10∶90→95∶5)，洗脱液减压蒸干；菌丝体用水混悬,混悬液经1 200～1 300 kPa均质，16 000 r/min离心，上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩蒸干。两部分粗提物经TLC检测后合并得总浸膏6 g。浸膏经过ODS中压硅胶柱(甲醇-水，体积比5∶95→100∶0)，得到8个流分(Fr.1～ Fr.8)，其中Fr.5依次经过Sephadex LH-20(甲醇)、正相硅胶柱层析反复得到化合物4(1.2 mg)，Fr.7依次经过Sephadex LH-20(甲醇)、正相硅胶柱层析纯化得到化合物1(17.0 mg)和2(47.0 mg)，Fr.8依次经过Sephadex LH-20(甲醇)、正相硅胶柱层析纯化得到化合物3(1.7 mg)。

3结构鉴定

化合物1为白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 259.108 2 [M-H]-(理论值为259.108 8)，分子式为C14H15N2O3。1H NMR (MeOD,400 MHz)δ: 7.05 (2H,d,J=8.4 Hz,H-5′,H-9′),6.71 (2H,d,J=8.5 Hz,H-6′,H-8′),4.35 (1H,m,H-2′),4.05 (1H,m,H-2),3.56 (1H,m,H-5),3.36 (1H,m,H-5),3.06 (2H,m,H-3′),2.10 (1H,m,H-3a),1.80 (2H,m,H-4),1.21 (1H,m,H-3b)。13C NMR (MeOD,125 MHz)δ: 170. 8 (C,C-1),166.9 (C,C-1′),157.6 (C,C-7′),132.1 (CH,C-5′,C-9′),127.6 (C,C-4′),116.2 (CH,C-6′,C-8′),60.0 (CH,C-2),57.9 (CH,C-2′),45.9 (CH2,C-5),37.6 (CH2,C-3′),29.4 (CH2,C-3),22.7 (CH2,C-4)。以上数据与文献[5-7]报道一致，故确定化合物1为环(L-脯氨酸-L-酪氨酸)[cylco(L-Pro-L-Tyr)]。

化合物2为白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 259.108 2[M-H]-(理论值为259.108 8)，分子式为C14H15N2O3。1H NMR (500 MHz,MeOD)δ: 6.98 (2H,d,J=8.5 Hz,H-5′,H-9′),6.73 (2H,d,J=8.4 Hz,H-6′,H-8′),4.15 (2H,t,J=8.9 Hz,4.4 Hz,H-2),3.52 (1H,m,H-2′),3.31 (1H,m,H-5),3.10 (1H,dd,J=13.9 Hz,4.5 Hz,H-3b′),2.88 (1H,dd,J=13.9 Hz,4.5 Hz,H-3a′),2.63 (1H,m,H-5),2.05 (1H,m,H-4),1.89 (1H,m,H-4),1.64 (2H,m,H-3a,H-3b)。13C NMR (MeOD,125 MHz)δ: 171.5 (C,C-1),167. 7 (C,C-1′),158.3 (C,C-7′),132.4 (CH,C-5′,C-9′),127.1 (C,C-4′),116.5 (CH,C-6′,C-8′),60.0 (CH,C-2),59.3 (CH,C-2′),46.2 (CH2,C-5),40.3 (CH2,C-3′),29.9 (CH2,C-3),22.6 (CH2,C-4)。以上数据与文献[5]报道一致，故确定化合物2为环(D-脯氨酸-L-酪氨酸)[cylco(D-Pro-L-Tyr)]。

化合物3为淡黄色针晶(甲醇)。ESI-MSm/z: 144.044 5[M-H]-(理论值为144.044 5)，分子式为C9H6NO；146.058 5[M+H]+(理论值为144.060 0)，分子式为C9H8NO。1H NMR (500 MHz,MeOD)δ: 9.89 (1H,s,CHO),8.16 (1H,d,J=7.5 Hz,H-4),8.10 (1H,s,H-2),7.48 (1H,d,J=7.9 Hz,H-7),7.28 (1H,t,H-6,J=15.0 Hz,7.25 Hz),7.24 (1H,t,H-5,J=15.0 Hz,7.5 Hz)。13C NMR (125 MHz,MeOD)δ: 187.6 (CH,CHO),139.8 (CH,C-2),125.2 (CH,C-5),123.8 (CH,C-6),122.5 (CH,C-4),113.3 (CH,C-7)。以上数据与文献[8-9]报道一致，故确定化合物3为3-吲哚甲醛(1H-indole-3-carboxaldehyde)。

化合物4为白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 257.076 9[M-H]-(理论值为257.077 9)，分子式为C10H13N2O6。1H-NMR (400 MHz,MeOD)δ: 8.10 (1H,d,J=8.1 Hz,H-6),5.95 (1H,d,J=3.6 Hz,H-1′),5.7 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),4.25 (1H,m,H-3′),3.98 (1H,m,H-4′),3.86 (2H,m,H-5′),3.75 (1H,dd,J=12.0 Hz,4.0 Hz,H-2′),3.53 (3H,s,-OCH3)。13C-NMR (125 MHz,MeOD)δ: 166.4 (C,C-4),152.3 (C,C-2),142.6 (CH,C-6),102.7 (CH,C-5),88.9 (CH,C-1′),86.3 (CH,C-4′),85.2 (CH,C-2′),69.9 (CH,C-3′),61.8 (CH2,C-5′),58.9 (CH3,2′-OCH3)。以上波谱数据与文献[10-11]报道一致，故确定化合物4为2′-O-甲基尿嘧啶核苷(2′-O-methyluridine)。

以上4个化合物的结构式见图1。

环(L-脯氨酸-L-酪氨酸)cylco(L-Pro-L-Tyr)环(D-脯氨酸-L-酪氨酸)cylco(D-Pro-L-Tyr)3-吲哚甲醛(1H-indole-3-carboxaldehyde)2'-O-甲基尿嘧啶核苷(2'-O-methyluridine)

图1深海细菌Psychrobactersubmarinus1A01998中分离得到的4个次级代谢产物

Figure 14 secondary metabolites isolated fromPsychrobactersubmarinus1A01998

4体外细胞毒活性测试结果

人肺癌细胞H1299以每孔(200 μL)2～5×103个细胞接种到96孔板上，以不含细胞的空白培养液作为对照。37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养24 h，分别加入1、5、10、20 μmol/L的化合物继续培养 72 h。每孔加5 mg/mL MTT 10 μL，37 ℃避光反应3 h。小心吸去上清液后，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪测定570 nm波长下各孔的吸收值。结果显示，在最高浓度20 μmol/L下，化合物1～4对人肺癌细胞H1299并未表现出生长抑制活性。

5讨论

据文献报道，嗜冷杆菌属的次级代谢产物主要含有胆汁酸衍生物和环二肽化合物[12-13]。本研究从海洋来源细菌Psychrobactersubmarinus1A01998中分离得到4个化合物，其中化合物1、2为该菌的主要次级代谢产物。这2个化合物此前在海洋来源的放线菌(Actinomadurasp. 01119[7]、Streptomycessp. 3275[5])和真菌(AspergillusaculeatusCGD12[14])中分离得到，且化合物1对金黄色葡萄球菌显示一定的抑制效果(MIC为32 mg/L)[14]。化合物3此前主要在细菌(StreptomycesaxinellaeSCSIO02208[15]和Pseudomonassp. WP168[16])中分离得到，有报道[17]在真菌中也存在。化合物1～4均为首次从嗜冷杆菌属中分离得到。

致谢：深海细菌Psychrobactersubmarinus1A01998由国家海洋局第三海洋研究所汤熙祥博士鉴定；另外，国家海洋局第三海洋研究所的夏金梅博士在MS测试期间给予了很大的帮助，在此致以诚挚的感谢。

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(责任编辑：陈翔)

Study on the secondary metabolites from the marine bacteriumPsychrobactersubmarinus1A01998

MA Xiaoni1，2,MIAO Zi1,2,CHENG Xuanxuan1,YANG Quan1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.KeyLaboratoryofMarineBiogeneticResources,ThirdInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Xiamen361005,China)

Abstract:Objective To study the secondary metabolites of Psychrobacter submarinus 1A01998,a deep-sea derived bacterium isolated from Pacific Ocean sediments. Methods Secondary metabolites were isolated and purified by column chromatography over macroporous resin,silica gel,ODS and Sephadex LH-20. The structures of secondary metabolites were identified by1H NMR,13C NMR,MS and reference data. Results Four secondary metabolites were obtained and identified as cylco (L-Pro-L-Tyr) (1),cylco(D-Pro-L-Tyr) (2), 1H-indole-3-carboxaldehyde (3), and 2′-O-methyluridine (4). Conclusion Compounds 1-4 were isolated from genus of Psychrobacter for the first time,and compounds 1 and 2 were cyclic dipeptides．

Key words:marine bacterium; Psychrobacter submarinus 1A01998; secondary metabolites

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110901

中图分类号：R284.2

文献标志码：A

文章编号:1006-8783(2016)01-0025-04

作者简介：马小妮(1990—)，女，2013级硕士研究生，Email:maxnym@163.com；通信作者：杨全(1972—)，男，博士，教授，主要从事中药资源方面研究，Email:yangquan7208@vip.163.com。

基金项目：国家海洋局第三海洋研究所基本科研业务费专项资金资助项目(2015028)；海洋经济创新发展区域示范专项经费资助项目(GD2012-D01-001)

收稿日期：2015-11-09

网络出版时间：2016-01-18 9:43网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160118.0943.002.html